【摘要】：本研究致力于研究以CD30核酸適配體為特異性靶向,具有緩釋效應(yīng)的載多柔比星(DOX)的靶向載藥系統(tǒng),為研究具有CD30高表達(dá)特性的惡性淋巴瘤提供了新型的藥物制劑設(shè)計(jì)思路。本研究合成了聚乙二醇(PEG)作為親水端,聚(乳酸-羥基乙酸)(PLGA)作為疏水端的兩嵌段化合物PEG-PLGA,抗腫瘤藥物多柔比星(Doxorubicin,DOX)被PEG-PLGA包載在納米粒內(nèi)部,而特異性靶向CD30的核酸適配體(CD30 Aptamer,C2NP)鍵合載DOX的PEG-PLGA納米粒表面,得到具有與CD30受體高度特異性結(jié)合的Apt-DOX-NPs。該載體材料通過(guò)乳化溶劑揮發(fā)法制得DOX-NPs與空白NPs,CD30 Aptamer通過(guò)EDC/NHS作用鍵合。本論文對(duì)PEG-PLGA的合成方法進(jìn)行選擇、分析研究載藥納米粒的制備與理化性質(zhì),對(duì)其體外釋放行為及其數(shù)學(xué)模型表達(dá)進(jìn)行擬合研究,還對(duì)靶向載藥納米粒的生物相容性以及抗腫瘤作用進(jìn)行探究和討論,具體闡述如下:(1)將采購(gòu)的PEG-PLGA材料進(jìn)行核磁共振分析,判斷材料是否符合試驗(yàn)要求。測(cè)量材料的靜態(tài)接觸角,判斷材料的親水特性。采用三種不同的方法:單乳法、透析法、乳化溶劑揮發(fā)法制備空白納米粒,以粒徑、多分散系數(shù)、Zeta電位為評(píng)價(jià)指標(biāo),SEM觀察空白納米粒的微觀形態(tài),發(fā)現(xiàn)乳化溶劑揮發(fā)法制得的空白納米粒的粒徑與Zeta電位結(jié)果最佳,選擇乳化溶劑揮發(fā)法作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)中納米粒的制備方法。(2)對(duì)于乳化溶劑揮發(fā)法制備的載藥納米粒,選取對(duì)DOX-NPs的制備影響較大的四個(gè)因素,進(jìn)行L9(3~4)正交試驗(yàn),利用SPSS軟件進(jìn)行分析,結(jié)果表明超聲時(shí)間對(duì)于DOX-NPs的包封率和粒徑結(jié)果影響最大。得到包封率最大效應(yīng)的最佳工藝條件為:PEG-PLGA的濃度為10 mg/mL,內(nèi)水相體積為200μL,超聲功率為220W,超聲時(shí)間為5min。(3)用EDC/NHS活化PEG-PLGA-NPs上的-COOH,與CD30 Aptamer上的-NH_2反應(yīng),使核酸適配體鍵合在DOX-NPs上,用傅里葉紅外光譜、聚丙烯酰胺凝膠電泳、X射線電子能譜驗(yàn)證CD30 Aptamer與DOX-NPs的成功綴合。使用間接法測(cè)量CD30Aptamer的連接效率為71.51±2.09%。(4)合成Apt-DOX-NPs,分析靶向載藥納米粒的理化性質(zhì),Apt-DOX-NPs的粒徑為187.87±2.03 nm,Zeta電位為30.77±0.153 mV,SEM及TEM觀察靶向載藥納米粒都沉規(guī)則的類(lèi)球形,形態(tài)均勻,分布無(wú)粘連。熱重結(jié)果表明Aptamer接載在DOX-NPs上并不改變納米粒的理化性質(zhì)。DOX-NPs的載藥量為1.63±0.10%,包封率為86.84±1.07%;而Apt-DOX-NPs的載藥量和包封率分別為1.58±3.60%和85.83±0.98%。(5)分析DOX-NPs的體外釋放呈現(xiàn)兩個(gè)階段,在24h之內(nèi)有明顯的藥物突釋,在24h-240h藥物平緩擴(kuò)散釋放藥物。發(fā)現(xiàn)在pH=5.5的釋放介質(zhì)中,DOX-NPs的累積釋放率要高于在pH=7.4的釋放介質(zhì)中,且DOX-NPs的體外釋放特性最符合Weibull方程。(6)選取高表達(dá)CD30受體的細(xì)胞(K299)細(xì)胞作為生物相容性的細(xì)胞模型,與抗體的競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CD30抗體與CD30 Aptamer靶向CD30受體表面的不同表位,Apt-DOX-NPs在細(xì)胞毒性、細(xì)胞攝取、細(xì)胞凋亡中結(jié)果均優(yōu)于DOX-NPs,可歸因于Aptamer介導(dǎo)的靶向作用。
【圖文】：

患者的潛在臨床影響。2 核酸適配體研究進(jìn)展與應(yīng)用2.1 核酸適配體的研究進(jìn)展核酸適配體是一種單鏈寡肽核酸，可由短鏈 RNA 或者單鏈 DNA 序列組成，當(dāng)獨(dú)特的三維構(gòu)象時(shí)，可以高特異性結(jié)合同源靶標(biāo)，解離常數(shù)通常在 pmol-nmol 的。可以通過(guò)指數(shù)富集(SELEX)的配體系統(tǒng)進(jìn)化的過(guò)程[30]，通過(guò)對(duì)給定靶標(biāo)的高特和力從組合的核算文庫(kù)中分離。由于它們具備選擇性結(jié)合蛋白質(zhì)的高親和力[31]，核酸適配體與抗體進(jìn)行比較，因此核酸適配體又被成為化學(xué)抗體。自從 1990 年發(fā)明以來(lái)，SELEX 技術(shù)已被修改病應(yīng)用于廣泛的靶標(biāo)，這有助于目標(biāo)靶標(biāo)結(jié)合的各種親和分子，無(wú)論目標(biāo)大小或者復(fù)雜性如何，核酸適配體都能的識(shí)別和結(jié)合各種靶標(biāo)物質(zhì)，例如化合物，肽，細(xì)胞，微生物和重組蛋白。

雖然有這優(yōu)點(diǎn)，，核酸適配體在體內(nèi)使用時(shí)，也有一定的限制性。作為核酸適配體它們很容易被生物環(huán)境中普遍存在的核酸酶降解，特別是基于 RNA 的核酸適配體更是如此。在過(guò)去的 30 年中，已經(jīng)產(chǎn)生了超過(guò) 2000 個(gè)核酸適配體。盡管取得了較大的進(jìn)步，但是治療性適配體的成功臨床應(yīng)用仍然存在比治療性抗體更大的滯后。只有一種核酸適配體，Pegaptanib[33]已被 FDA 批準(zhǔn)用于臨床，這種靶向血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）的適配體仍然沒(méi)有超過(guò)抗 VEGF 的單克隆抗體，如雷珠單抗和貝伐單抗的治療效果。目前
【學(xué)位授予單位】：華南理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R943

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本文編號(hào)：2667373