【摘要】：本研究致力于研究以CD30核酸適配體為特異性靶向,具有緩釋效應的載多柔比星(DOX)的靶向載藥系統(tǒng),為研究具有CD30高表達特性的惡性淋巴瘤提供了新型的藥物制劑設計思路。本研究合成了聚乙二醇(PEG)作為親水端,聚(乳酸-羥基乙酸)(PLGA)作為疏水端的兩嵌段化合物PEG-PLGA,抗腫瘤藥物多柔比星(Doxorubicin,DOX)被PEG-PLGA包載在納米粒內(nèi)部,而特異性靶向CD30的核酸適配體(CD30 Aptamer,C2NP)鍵合載DOX的PEG-PLGA納米粒表面,得到具有與CD30受體高度特異性結(jié)合的Apt-DOX-NPs。該載體材料通過乳化溶劑揮發(fā)法制得DOX-NPs與空白NPs,CD30 Aptamer通過EDC/NHS作用鍵合。本論文對PEG-PLGA的合成方法進行選擇、分析研究載藥納米粒的制備與理化性質(zhì),對其體外釋放行為及其數(shù)學模型表達進行擬合研究,還對靶向載藥納米粒的生物相容性以及抗腫瘤作用進行探究和討論,具體闡述如下:(1)將采購的PEG-PLGA材料進行核磁共振分析,判斷材料是否符合試驗要求。測量材料的靜態(tài)接觸角,判斷材料的親水特性。采用三種不同的方法:單乳法、透析法、乳化溶劑揮發(fā)法制備空白納米粒,以粒徑、多分散系數(shù)、Zeta電位為評價指標,SEM觀察空白納米粒的微觀形態(tài),發(fā)現(xiàn)乳化溶劑揮發(fā)法制得的空白納米粒的粒徑與Zeta電位結(jié)果最佳,選擇乳化溶劑揮發(fā)法作為后續(xù)實驗中納米粒的制備方法。(2)對于乳化溶劑揮發(fā)法制備的載藥納米粒,選取對DOX-NPs的制備影響較大的四個因素,進行L9(3~4)正交試驗,利用SPSS軟件進行分析,結(jié)果表明超聲時間對于DOX-NPs的包封率和粒徑結(jié)果影響最大。得到包封率最大效應的最佳工藝條件為:PEG-PLGA的濃度為10 mg/mL,內(nèi)水相體積為200μL,超聲功率為220W,超聲時間為5min。(3)用EDC/NHS活化PEG-PLGA-NPs上的-COOH,與CD30 Aptamer上的-NH_2反應,使核酸適配體鍵合在DOX-NPs上,用傅里葉紅外光譜、聚丙烯酰胺凝膠電泳、X射線電子能譜驗證CD30 Aptamer與DOX-NPs的成功綴合。使用間接法測量CD30Aptamer的連接效率為71.51±2.09%。(4)合成Apt-DOX-NPs,分析靶向載藥納米粒的理化性質(zhì),Apt-DOX-NPs的粒徑為187.87±2.03 nm,Zeta電位為30.77±0.153 mV,SEM及TEM觀察靶向載藥納米粒都沉規(guī)則的類球形,形態(tài)均勻,分布無粘連。熱重結(jié)果表明Aptamer接載在DOX-NPs上并不改變納米粒的理化性質(zhì)。DOX-NPs的載藥量為1.63±0.10%,包封率為86.84±1.07%;而Apt-DOX-NPs的載藥量和包封率分別為1.58±3.60%和85.83±0.98%。(5)分析DOX-NPs的體外釋放呈現(xiàn)兩個階段,在24h之內(nèi)有明顯的藥物突釋,在24h-240h藥物平緩擴散釋放藥物。發(fā)現(xiàn)在pH=5.5的釋放介質(zhì)中,DOX-NPs的累積釋放率要高于在pH=7.4的釋放介質(zhì)中,且DOX-NPs的體外釋放特性最符合Weibull方程。(6)選取高表達CD30受體的細胞(K299)細胞作為生物相容性的細胞模型,與抗體的競爭試驗發(fā)現(xiàn)CD30抗體與CD30 Aptamer靶向CD30受體表面的不同表位,Apt-DOX-NPs在細胞毒性、細胞攝取、細胞凋亡中結(jié)果均優(yōu)于DOX-NPs,可歸因于Aptamer介導的靶向作用。
【圖文】：

患者的潛在臨床影響。2 核酸適配體研究進展與應用2.1 核酸適配體的研究進展核酸適配體是一種單鏈寡肽核酸，可由短鏈 RNA 或者單鏈 DNA 序列組成，當獨特的三維構(gòu)象時，可以高特異性結(jié)合同源靶標，解離常數(shù)通常在 pmol-nmol 的。可以通過指數(shù)富集(SELEX)的配體系統(tǒng)進化的過程[30]，通過對給定靶標的高特和力從組合的核算文庫中分離。由于它們具備選擇性結(jié)合蛋白質(zhì)的高親和力[31]，核酸適配體與抗體進行比較，因此核酸適配體又被成為化學抗體。自從 1990 年發(fā)明以來，SELEX 技術(shù)已被修改病應用于廣泛的靶標，這有助于目標靶標結(jié)合的各種親和分子，無論目標大小或者復雜性如何，核酸適配體都能的識別和結(jié)合各種靶標物質(zhì)，例如化合物，肽，細胞，微生物和重組蛋白。

雖然有這優(yōu)點，，核酸適配體在體內(nèi)使用時，也有一定的限制性。作為核酸適配體它們很容易被生物環(huán)境中普遍存在的核酸酶降解，特別是基于 RNA 的核酸適配體更是如此。在過去的 30 年中，已經(jīng)產(chǎn)生了超過 2000 個核酸適配體。盡管取得了較大的進步，但是治療性適配體的成功臨床應用仍然存在比治療性抗體更大的滯后。只有一種核酸適配體，Pegaptanib[33]已被 FDA 批準用于臨床，這種靶向血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的適配體仍然沒有超過抗 VEGF 的單克隆抗體，如雷珠單抗和貝伐單抗的治療效果。目前
【學位授予單位】：華南理工大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R943

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本文編號：2667373