發(fā)布時(shí)間：2020-05-16 09:30

【摘要】：目的:藥物影響心肌細(xì)胞的離子通道,會(huì)使動(dòng)作電位復(fù)極化時(shí)程延長(zhǎng),在心電圖(ECG)上表現(xiàn)為QT間期延長(zhǎng),易誘發(fā)早后除極(EAD),增加室性心動(dòng)過速的風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)而可能引發(fā)心性猝死,是新藥研發(fā)失敗和上市后藥物撤市的重要原因。因此,檢測(cè)新化學(xué)實(shí)體(NCE)對(duì)心肌細(xì)胞離子通道的影響,評(píng)估其潛在的致心律失常風(fēng)險(xiǎn)是新藥研發(fā)早期安全性篩查的必要內(nèi)容。近年來研究表明,人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化的心肌細(xì)胞(hiPSC-CMs)具有與成年人心肌細(xì)胞比較相似的電生理特征,可以解決動(dòng)物心肌細(xì)胞電生理與人類相差很大的種屬問題,而且與異源表達(dá)細(xì)胞系相比,hiPSC-CMs對(duì)藥物反應(yīng)更加敏感。因此,近年美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)聯(lián)合健康與環(huán)境科學(xué)研究所(HESI)等國(guó)際組織提出了“藥物致心律失常體外綜合評(píng)價(jià)(簡(jiǎn)稱CiPA)”這一新模式,而采用hiPSC-CMs在細(xì)胞水平直接檢測(cè)藥物致心律失常的風(fēng)險(xiǎn)是其中重要的一部分,可望成為早期心臟安全性篩查的新策略。目前,國(guó)內(nèi)沒有國(guó)際通用的商業(yè)化hiPSC-CMs,只有少數(shù)公司在研發(fā)hiPSC-CMs,基于該細(xì)胞的電生理指標(biāo)的評(píng)價(jià)體系尚未見報(bào)道。為此,本課題擬利用hiPSC-CMs建立藥物致心律失常風(fēng)險(xiǎn)篩查技術(shù)平臺(tái),有望在新藥研發(fā)過程中及早發(fā)現(xiàn)新藥潛在的致命性不良反應(yīng),從而合理評(píng)估藥物的研發(fā)前景,這對(duì)創(chuàng)新藥物的研發(fā)具有十分重要的意義。方法:1.免疫熒光染色:對(duì)day 7的細(xì)胞進(jìn)行cTNT和α-actin的免疫熒光染色,在共聚焦顯微鏡下進(jìn)行掃描,通過熒光表達(dá)情況,對(duì)hiPSC-CMs進(jìn)行驗(yàn)證。2.RT-PCR:使用微量樣品總RNA提取試劑盒對(duì)hiPSC-CMs的RNA進(jìn)行提取,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后,經(jīng)RT-PCR檢測(cè)hERG、KCNQ1、KCNE1、Nav1.5和Cav1.2的mRNA表達(dá)情況。3.全自動(dòng)心肌細(xì)胞多功能檢測(cè)平臺(tái)(CardioExcyte 96,德國(guó)Nanion Technologies)檢測(cè):將hiPSC-CMs按照供應(yīng)商提供的步驟進(jìn)行復(fù)蘇,用纖維連結(jié)蛋白包被專用96孔電極板(型號(hào):NSP96-0.6)后,將用臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)后的細(xì)胞懸液以3.0萬/孔接種到電極板中。對(duì)細(xì)胞的base imp(代表細(xì)胞貼壁程度)、BR(搏動(dòng)頻率)和FPDc(max)(BR校正后的場(chǎng)電位時(shí)程)等主要參數(shù)每隔3 h監(jiān)測(cè)一次,持續(xù)監(jiān)測(cè)至上述參數(shù)達(dá)到穩(wěn)定。穩(wěn)定后加入高、中、低三種風(fēng)險(xiǎn)藥物共12種(由FDA推薦),每種藥物設(shè)高、中、低三個(gè)濃度,每個(gè)濃度設(shè)三個(gè)復(fù)孔,在加藥后連續(xù)監(jiān)測(cè)24 h(前2 h內(nèi)每5 min監(jiān)測(cè)一次,之后每1 h監(jiān)測(cè)一次),觀察藥物對(duì)hiPSC-CMs場(chǎng)電位的影響并進(jìn)行計(jì)算和統(tǒng)計(jì)。結(jié)果:1.hiPSC-CMs的驗(yàn)證:在倒置顯微鏡下觀察day 2和day 7細(xì)胞,可發(fā)現(xiàn)細(xì)胞貼壁變大呈梭形,均勻分布在培養(yǎng)皿中形成了單細(xì)胞層,并開始同步搏動(dòng);通過對(duì)day 7細(xì)胞熒光染色后,在共聚焦顯微鏡下可以觀察到心肌特異性標(biāo)志物cTNT和α-actin的熒光;RT-PCR結(jié)果顯示,對(duì)day 1和day 7細(xì)胞的RT-PCR驗(yàn)證,包括hERG、KCNQ1、KCNE1、Nav1.5以及Cav1.2等離子通道在mRNA水平均有表達(dá)。綜合以上結(jié)果可判定誘導(dǎo)分化的細(xì)胞為心肌細(xì)胞。2.場(chǎng)電位背景數(shù)據(jù):在hiPSC-CMs復(fù)蘇7天后,場(chǎng)電位的各項(xiàng)參數(shù)(base imp、BR和FPDc(max))均達(dá)到穩(wěn)定,可以進(jìn)行后續(xù)給藥;穩(wěn)定后的hiPSC-CMs的基本參數(shù)BR為60-80/min,FPDc(max)為0.1-0.4 s,與國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道基本一致。3.藥物誘發(fā)心律失常的情況:實(shí)驗(yàn)中可發(fā)現(xiàn)藥物誘發(fā)早后除極和觸發(fā)電活動(dòng)(TA)的心律失�，F(xiàn)象,后者表現(xiàn)為震蕩性除極和不規(guī)則搏動(dòng)兩種形式;在給藥后出現(xiàn)連續(xù)三次以上任意一種上述類型波形都會(huì)判定為發(fā)生心律失常。高風(fēng)險(xiǎn)藥物(芐普地爾、多非利特、奎尼丁、索他洛爾)在中、高濃度幾乎全部會(huì)誘發(fā)心律失�，F(xiàn)象,而中、低風(fēng)險(xiǎn)藥物(氯丙嗪、西沙必利、特非那定、昂丹司瓊、地爾硫卓、雷諾嗪、維拉帕米)中,除美西律外心律失常只見于高濃度。4.藥物引發(fā)停跳現(xiàn)象:給藥后出現(xiàn)超過3小時(shí)以上時(shí)間的停跳被記為出現(xiàn)停跳現(xiàn)象。高風(fēng)險(xiǎn)藥物除索他洛爾外均易引發(fā)停跳現(xiàn)象;中風(fēng)險(xiǎn)藥物在高濃度易引發(fā)停跳現(xiàn)象;低風(fēng)險(xiǎn)藥物除美西律外幾乎不會(huì)出現(xiàn)停跳現(xiàn)象。5.藥物引發(fā)場(chǎng)電位改變:關(guān)于BR和FPDc(max)的統(tǒng)計(jì)則是采用自身比較法,將給藥后2 h內(nèi)和24 h內(nèi)穩(wěn)定后的數(shù)值與給藥前的數(shù)值進(jìn)行比較,計(jì)算各孔參數(shù)的變化率。三類風(fēng)險(xiǎn)藥物未見引發(fā)上述參數(shù)規(guī)律性的改變,亦無明顯的濃度依賴性改變。6.與國(guó)際數(shù)據(jù)的比較:與國(guó)際其他機(jī)構(gòu)的到的數(shù)據(jù)相比較大部分相符,有小部分?jǐn)?shù)據(jù)有所出入。結(jié)論:國(guó)內(nèi)商業(yè)化hiPSC-CMs對(duì)藥物反應(yīng)敏感,以是否出現(xiàn)心律失�，F(xiàn)象來看,可區(qū)分開高風(fēng)險(xiǎn)藥物和中低風(fēng)險(xiǎn)藥物,但中低風(fēng)險(xiǎn)藥物區(qū)分不開;結(jié)合停跳現(xiàn)象來看,可較好地區(qū)分開高、中、低三種風(fēng)險(xiǎn)藥物。
【圖文】：

hiPSC-CMs的形態(tài)學(xué)觀察Fig.1ThemorphologyofhiPSC-CMs.(A)Photographofday2andday7.(B)

hiPSC-CMs心臟離子通道的表達(dá)Fig.2ExpressionofcardiacionchannelgenesinhiPSC-CMs.(A)PresenceofcardiacionchannelgenesinhiPSC-CMs.(B)ComparisonoftheexpressionofcardiacionchannelgenesinhiPSC-CMsbetweenday1andday7.n=3.*P㩳0.05
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R96

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