【摘要】：線粒體與溶酶體相互作用,包括線粒體與溶酶體融合和線粒體與溶酶體接觸,是真核細(xì)胞中維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的重要過程,涉及到許多疾病。然而目前對(duì)于線粒體與溶酶體的相互作用的研究方法仍停留在細(xì)胞水平,對(duì)亞細(xì)胞器納米級(jí)動(dòng)態(tài)相互作用的研究仍十分有限。在這里,我們突破以往針對(duì)單個(gè)細(xì)胞器進(jìn)行研究的局限和常規(guī)顯微鏡分辨率的限制,以線粒體與溶酶體相互作用為研究主線,借助超分辨顯微成像技術(shù)的優(yōu)勢(shì),建立了在納米水平下線粒體與溶酶體相互作用研究的新方法,擴(kuò)展了超分辨成像在藥物評(píng)價(jià)中的應(yīng)用。首先,在超分辨顯微鏡下捕獲了不同條件下的線粒體與溶酶體互作的類型并對(duì)不同類型進(jìn)行了定量分析;然后,為了更好的觀測(cè)線粒體與溶酶體的相互作用,開發(fā)了一個(gè)可以在超分辨顯微鏡下進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)監(jiān)測(cè)線粒體動(dòng)力學(xué)的銥(Ⅲ)配合物探針;為了特異性成像線粒體與溶酶體的接觸位點(diǎn)以及簡(jiǎn)化現(xiàn)行的染色過程,制備了一個(gè)可以同時(shí)成像線粒體與溶酶體的雙標(biāo)探針;同時(shí)揭示了 VAMP8蛋白可作為線粒體與溶酶體相互作用網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵的藥物調(diào)控靶點(diǎn);最后,以線粒體與溶酶體相互作用為模型,從多個(gè)角度論證了超分辨成像作為藥物評(píng)價(jià)新策略的準(zhǔn)確性。1 超分辨成像揭示線粒體與溶酶體的相互作用超分辨光學(xué)顯微鏡將細(xì)胞生物學(xué)的范圍從細(xì)胞水平擴(kuò)展到納米尺度,使研究人員能夠觀察單個(gè)線粒體與溶酶體的相互作用行為,如接觸或者融合。為了在超分辨顯微鏡下捕獲線粒體與溶酶體的相互作用行為并對(duì)這些行為進(jìn)行區(qū)別。在這里,我們使用結(jié)構(gòu)光照明顯微鏡(structured illumination microscopy,SIM)來(lái)研究線粒體與溶酶體的相互作用并提出M值(其值為垂直于線粒體和溶酶體接觸方向熒光強(qiáng)度的重疊區(qū)域)來(lái)定量研究和區(qū)分線粒體的接觸和融合等不同的相互作用形式。我們發(fā)現(xiàn)線粒體與溶酶體接觸的M值通常小于0.4,而在線粒體與溶酶體融合的M值范圍在0.5到1.0之間。使用超分辨顯微鏡以及M值定量系統(tǒng)可有助于進(jìn)一步研究線粒體與溶酶體相互作用的分子機(jī)制。2 長(zhǎng)時(shí)銥(Ⅲ)配合物熒光探針追蹤線粒體動(dòng)力學(xué)并用于監(jiān)測(cè)線粒體與溶酶體相互作用目前,商用線粒體探針普遍存在易光漂白等缺點(diǎn),并不能滿足在SIM下長(zhǎng)時(shí)間觀測(cè)線粒體動(dòng)力學(xué)的需求。為此,我們開發(fā)了一種銥(Ⅲ)探針,用于實(shí)現(xiàn)在SIM下長(zhǎng)時(shí)間跟蹤活細(xì)胞中的線粒體,開展線粒體動(dòng)力學(xué)研究。結(jié)果表明,該探針表現(xiàn)出優(yōu)異的線粒體成像特異性和光穩(wěn)定性以及細(xì)胞滲透性。當(dāng)在SIM下成像線粒體時(shí),可捕獲高達(dá)80 nm的分辨率,從而可以清晰地觀察到線粒體嵴的結(jié)構(gòu)。然后,我們使用該探針與商用的溶酶體探針搭配使用來(lái)研究線粒體與溶酶體的相互作用行為,如線粒體與溶酶體的接觸和融合。結(jié)果表明,當(dāng)5個(gè)自噬相關(guān)受體p62、NDP 52、OPTN、NBR 1和TAX1BP 1被敲除時(shí),線粒體與溶酶體的接觸保持存在,而融合消失,表明這兩個(gè)過程是獨(dú)立的。這一探針的開發(fā),為在超分辨下研究線粒體與溶酶體的互作研究方法的建立提供了有力的工具。3 雙靶向探針用于同時(shí)成像活細(xì)胞中線粒體與溶酶體相互作用已經(jīng)開發(fā)了各種優(yōu)異熒光探針來(lái)分別成像線粒體與溶酶體來(lái)研究其互作,但是,目前并不能突破一個(gè)探針可同時(shí)成像線粒體與溶酶體的技術(shù)壁壘。為了解決這個(gè)問題,我們?cè)O(shè)計(jì)了一種細(xì)胞滲透性高,生物相容性好,且響應(yīng)黏度的小分子探針,Coupa,以同時(shí)監(jiān)測(cè)活細(xì)胞中線粒體與溶酶體的相互作用。這個(gè)探針可通過在溶酶體上發(fā)射紅光,而在線粒體上發(fā)射藍(lán)光來(lái)同時(shí)標(biāo)記線粒體和溶酶體。利用紅藍(lán)熒光強(qiáng)度之間的相關(guān)性可衡量在生命過程中線粒體與溶酶體的接觸和融合所處的階段。此外,該探針的熒光具有極高黏度性敏感性,可識(shí)別并定位線粒體與溶酶體接觸位點(diǎn)�；谠撎结樀膬�(yōu)越性,我們首次揭示了線粒體與溶酶體的接觸位點(diǎn)與線粒體局部黏度變化有關(guān)。因此,該探針的開發(fā)為超分辨在活細(xì)胞中研究線粒體與溶酶體相互作用以及接觸位點(diǎn)的識(shí)別提供了一個(gè)有力的工具。4 溶酶體與線粒體相互作用網(wǎng)絡(luò)的維持和調(diào)控靶點(diǎn)蛋白發(fā)現(xiàn)在線粒體與溶酶體相互作用過程中,溶酶體會(huì)以聚集簇的形式圍繞在線粒體周圍,為了明確在互作過程中溶酶體聚集簇的形成原因和調(diào)控機(jī)制,我們對(duì)此進(jìn)行了深入研究。在線粒體與溶酶體相互作用過程,自噬體包裹受損的線粒體再與溶酶體融合來(lái)執(zhí)行細(xì)胞自噬的過程。溶酶體與自噬體問的融合過程是自噬的關(guān)鍵步驟。雖然已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了許多蛋白可調(diào)節(jié)這個(gè)融合過程,但是溶酶體形成聚集簇樣的融合前狀態(tài)和調(diào)節(jié)機(jī)制仍然是未知的。本研究的結(jié)果表明,在細(xì)胞受到刺激后,多個(gè)溶酶體可形成聚集簇與自噬體進(jìn)行融合,這一聚集簇的形成是為了提高細(xì)胞的自噬效率。此外,溶酶體上的融合蛋白VAMP8在溶酶體聚集簇形成過程中起到了雙向調(diào)節(jié)作用。如在正常條件下,細(xì)胞通過VAMP8的磷酸化起到了抑制融合的作用,阻礙融合以抑制自噬的發(fā)生;在應(yīng)急狀態(tài)下,細(xì)胞通過VAMP8的去磷酸化起到了加速融合的作用,以增加自噬的發(fā)生。這些結(jié)果表明,VAMP8可作為一個(gè)調(diào)控靶點(diǎn)調(diào)節(jié)溶酶體與線粒體互作網(wǎng)絡(luò)的形成。5 基于線粒體與溶酶體互作模型的藥物評(píng)價(jià)和篩選基于超分辨顯微技術(shù)以獲得納米級(jí)藥效學(xué)評(píng)估是一種具有潛力的高通量篩選新策略。在這里,我們以線粒體與溶酶體相互作用為模型,結(jié)合自動(dòng)分析軟件論證了這一策略作為藥物篩選和評(píng)價(jià)的可行性。該策略可在納米水平捕獲藥物對(duì)線粒體的超微結(jié)構(gòu)的變化,以及線粒體與溶酶體相互作用的細(xì)微差別,并可直接反映出基因缺陷和藥物對(duì)相互作用的干預(yù)。此外,該策略還提供了超高分辨率的圖像有利于提高大規(guī)模人工智能圖像識(shí)別的準(zhǔn)確率,并有可能縮短藥物的研發(fā)周期。
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山東大學(xué)博士學(xué)位論文線粒體的外膜與質(zhì)膜類似，其蛋白質(zhì)－磷脂比例為線粒體的內(nèi)膜中蛋白質(zhì)－磷脂比（大于３：邋１），這差，也是眾多熒光探針能夠用來(lái)標(biāo)記線粒體的原因在外膜和內(nèi)膜的中間部分，含有小分子，如離子粒體的內(nèi)膜彎曲形成的褶皺結(jié)構(gòu)以增加表面積，，］。逡逑該結(jié)構(gòu)由內(nèi)膜所包裹，其體積約為線粒體總體積的邋ｍｔＤＮＡ存在于線粒體基質(zhì)，呈現(xiàn)小圓狀的形式。逡逑

可被兩個(gè)溶酶體組織蛋白酶Ｂ和Ｄ所切割，然后ＢＩＤ激性，導(dǎo)致細(xì)胞色素Ｃ的釋放和依賴于凋亡小體的ｃａｓｐａｓｅ和自噬逡逑胞自行降解大分子物質(zhì)和循環(huán)再利用的過程，包括大自導(dǎo)的自j（ｃｏｍｐａｎｉｏｎ邋ｍｅｄｉａｔｅｄ邋ａｕｔｏｐｈａｇｙ，ＣＭＡ）邋［２８］。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)來(lái)源的膜形成自噬體，與溶酶體融合（圖１．３）形受損的細(xì)胞器或者大分子；在小自噬過程中，溶酶體直；第３種溶酶體降解途徑是ＣＭＡ，在ＣＭＡ中，胞質(zhì)蛋運(yùn)到溶酶體中進(jìn)行降解（圖１．２）。逡逑酶體還參與其它生命過程［２９］，如：參與分泌過程的調(diào)節(jié)，成有活性的甲狀腺素［３（）］；精子的頂體形成，利用頂體于精子進(jìn)入卵子，參與受精過程［３１］。逡逑凋ｔ逡逑
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R96


本文編號(hào)：2661545