【摘要】：實驗背景:腫瘤是一種常見且多發(fā)的疾病,在今天依然威脅著人類的生命和健康。引起腫瘤發(fā)生的因素有很多,例如外在的環(huán)境因素中物理、化學和生物致癌因素,內在的人體自身免疫功能及遺傳因素等。腫瘤之所以難以攻克,主要原因是腫瘤的發(fā)生是一種涉及腫瘤細胞異常生長且入侵到身體其他正常部位所誘發(fā)相關疾病的集合。微管在細胞有絲分裂過程中扮演重要角色,這一重要作用使得微管成為抗腫瘤治療的重要靶標,而微管蛋白是構成微管系統(tǒng)必不可少的基礎單位。若微管蛋白遭到破壞,微管系統(tǒng)則會失去其穩(wěn)定性,最終對細胞有絲分裂的影響也是不言而喻的�；谖⒐艿鞍自诩毎芯哂械闹匾袨�,能與微管蛋白相互作用的藥物也越來越多的被開發(fā)和研究,同時一些已經在臨床上被批準用于腫瘤的治療。實驗目的:本實驗就新型微管蛋白抑制劑A3對人宮頸癌HeLa細胞活性的評價及其抗腫瘤作用機制的研究。實驗方法:采用微管蛋白聚合篩選試劑盒分別對紫杉醇、CA-4及A3進行微管蛋白聚合抑制的檢測。用免疫熒光法檢測不同濃度的A3對HeLa細胞內微管蛋白的影響。采用MTT法檢測A3對HeLa細胞生長增殖的影響。用倒置熒光顯微鏡觀察A3對HeLa細胞的形態(tài)學及細胞內微管蛋白的影響。采用高內涵活細胞成像系統(tǒng)(HSC)檢測A3對HeLa細胞線粒體膜電位(Rh123/Hoechst 33342)、活性氧(DCFH-DA/Hoechst 33342)的影響。用流式細胞儀檢測A3對HeLa細胞的周期(PI)、凋亡(FITC AnnexinV/PI)、線粒體膜電位(JC-1)及活性氧(DHE)的影響。用細胞劃痕和Transwell實驗檢測A3對HeLa和HUVEC細胞遷移的影響。采用Western blotting檢測A3對HeLa細胞內周期相關蛋白(cyclin B1、cyclin D1)、凋亡相關蛋白(Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、Bax、XIAP)及細胞色素C變化的影響。用人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)進行小管形成實驗來檢測A3的抗血管生成能力。實驗結果:1、高通量微管蛋白聚合篩選試劑盒檢測發(fā)現(xiàn)A3能抑制微管蛋白的聚合,并且成劑量依賴性。2、免疫熒光法檢測發(fā)現(xiàn)A3能影響HeLa細胞內微管蛋白的變化,且使其分布呈彌散狀。3、MTT實驗檢測發(fā)現(xiàn)A3對HeLa細胞的生長具有明顯的抑制作用,并且呈時間與劑量依賴性。4、通過細胞形態(tài)學觀察發(fā)現(xiàn)A3誘導HeLa細胞發(fā)生了凋亡。5、流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)A3能誘導HeLa細胞發(fā)生明顯的G2/M期阻滯及凋亡,同時還能引起細胞內線粒體膜電位的降低及活性氧的變化。6、細胞劃痕和Transwell實驗發(fā)現(xiàn)A3能抑制HeLa與HUVEC細胞的遷移。7、Western blotting檢測發(fā)現(xiàn)A3能調控HeLa細胞的周期相關蛋白及凋亡相關蛋白的表達,并且呈時間與劑量依賴性。8、小管形成實驗發(fā)現(xiàn)A3能夠抑制人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)形成小管,表現(xiàn)出了抗血管生成的作用。實驗結論:新型微管蛋白抑制劑A3對HeLa細胞表現(xiàn)出了明顯的細胞毒性作用。主要是以微管蛋白為作用靶標,通過抑制微管蛋白的聚合,引起HeLa細胞的周期停滯,再經線粒體途徑誘導HeLa細胞凋亡的發(fā)生,同時還具有抑制HeLa細胞的遷移及周圍血管的生成,最終發(fā)揮抗腫瘤作用。
【學位授予單位】：河南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R96

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