【摘要】：目的制備和表征氧化石墨烯(GO)修飾的載阿霉素(DOX)聚乳酸(PLA)微泡,考察此藥物遞送體系體內(nèi)外超聲顯影效果、對人乳腺癌MCF-7細胞體外活性影響以及在小鼠體內(nèi)急性毒性情況。方法采用改良的Hummer’s法制備氧化石墨烯,合成氧化石墨烯與聚乙烯醇(PVA)的偶聯(lián)物(GO-PVA)并進行表征。以阿霉素(DOX)作為模型藥物,采用復(fù)乳化-溶劑揮發(fā)法聯(lián)合酰胺反應(yīng)制備葉酸(FA)修飾的載阿霉素PLA復(fù)合微泡超聲造影劑(FA-DOX/GO-DOX/PLA)。以PLA濃度、PVA濃度、PVA用量、異丙醇濃度為考察對象,以微泡的外觀形態(tài)、粒徑、穩(wěn)定性為評價指標,通過L9(3~4)正交試驗篩選制備微泡的最優(yōu)處方,以初乳和復(fù)乳的制備超聲功率、磁力攪拌時間、離心轉(zhuǎn)速為考察對象,以微泡的外觀形態(tài)、粒徑、穩(wěn)定性為評價指標,通過L9(3~4)正交試驗篩選制備微泡的最佳制備工藝。隨后,對FA-DOX/GO-DOX/PLA復(fù)合微泡的外觀形態(tài)、粒徑、Zeta電位以及復(fù)合微泡中DOX和GO的負載率進行表征。采用CCK-8法檢測FA-DOX/GO-DOX/PLA復(fù)合微泡對乳腺癌MCF-7細胞的體外增殖抑制情況。采用吖啶橙染色觀察藥物作用后乳腺癌MCF-7細胞的活性。采用一次性腹腔注射復(fù)合微泡的方式進行染毒觀察KM小鼠毒性反應(yīng)及死亡情況,寇氏法計算LD_(50)及95%置信區(qū)間。采用多普勒彩色超聲成像系統(tǒng)觀察復(fù)合微泡體內(nèi)外超聲顯影效果。結(jié)果FA-DOX/GO-DOX/PLA復(fù)合微泡的最優(yōu)處方為PLA濃度0.06 g·mL~(-1)、PVA濃度3.50%、PVA(3.50%)用量40 mL、異丙醇濃度5.50%;最佳制備工藝為初乳制備超聲功率120 W、復(fù)乳制備超聲功率210 W、磁力攪拌時間2.5 h、離心轉(zhuǎn)速2400r·min~(-1)。根據(jù)篩選出的最優(yōu)處方及最佳制備工藝制備的FA-DOX/GO-DOX/PLA復(fù)合微泡呈規(guī)則圓整的球形,粒徑分布集中,平均粒度為600 nm左右,Zeta電位為(-37.50?10.00)mV,復(fù)合微泡中DOX負載率為(7.42?0.62)%,GO負載率為(19.56?0.27)%。體外細胞實驗表明在同一藥物濃度水平下,不同給藥組對腫瘤細胞均呈劑量依賴性,且FA-DOX/GO-DOX/PLA微泡、載藥GO修飾復(fù)合PLA微泡(DOX/GO-DOX/PLA微泡)、載藥PLA微泡(DOX/PLA微泡)、載藥GO修飾空白PLA微泡(DOX/GO-PLA微泡)和free DOX組對MCF-7細胞的增殖抑制作用依次遞減,具有統(tǒng)計學意義。通過采用吖啶橙(AO)熒光染色后觀察發(fā)現(xiàn),不同給藥組均對細胞活性產(chǎn)生抑制作用,誘導(dǎo)凋亡,但FA-DOX/GO-DOX/PLA復(fù)合微泡對細胞的抑制作用強于其他各給藥組。小鼠急性毒性試驗中,采用寇氏法計算復(fù)合微泡的半數(shù)致死量,小鼠經(jīng)腹腔注射復(fù)合微泡的LD_(50)為87.53 mg·kg~(-1),95%置信區(qū)間為(74.25~103.19)mg·kg~(-1)。體內(nèi)外超聲顯影評價中,采用多普勒彩色超聲成像系統(tǒng)檢測到復(fù)合微泡超聲造影劑體外成像效果顯著強于對照組,復(fù)合微泡超聲造影劑在新西蘭兔主要器官中具有良好的超聲顯影效果,且能夠安全順利的在體內(nèi)進行循環(huán)。結(jié)論通過復(fù)乳化-溶劑揮發(fā)法、L9(3~4)正交試驗制備的FA-DOX/GO-DOX/PLA復(fù)合微泡粒徑、Zeta電位、包封率、載藥量及穩(wěn)定性較好。體外細胞實驗表明,與其他給藥組相比,FA的修飾可以通過與細胞表面FA受體特異性結(jié)合極大提高阿霉素對乳腺癌MCF-7細胞的細胞毒性。一次性腹腔注射復(fù)合微泡后,復(fù)合微泡對KM小鼠的精神狀況、行為動作均無明顯毒性,具備生物安全性。復(fù)合微泡體內(nèi)外超聲造影效果顯著增強。因此,本課題初步證實FA-DOX/GO-DOX/PLA復(fù)合微泡是一種具有廣闊應(yīng)用前景的靶向遞藥系統(tǒng)。
【圖文】：

佳木斯大學碩士學位論文光光度計在 513 nm 處測定吸光度值，代入標準曲線方程得相應(yīng)濃度，計算回收率。2.3 結(jié)果與討論2.3.1 阿霉素體外分析方法的建立結(jié)果2.3.1.1 檢測波長的確立采用紫外分光光度計對阿霉素標準溶液、空白 PLA 微泡溶液進行掃描，結(jié)果見圖 2-1、圖 2-2。由掃描光譜可知，阿霉素的最大吸收波長為 480 nm。在 DOX 的最大吸收波長 480 nm 處，，相應(yīng)濃度的空白 PLA 微泡溶液無干擾，故選定 480 nm 作為 DOX的檢測波長。

佳木斯大學碩士學位論文光光度計在 513 nm 處測定吸光度值，代入標準曲線方程得相應(yīng)濃度，計算回收率。2.3 結(jié)果與討論2.3.1 阿霉素體外分析方法的建立結(jié)果2.3.1.1 檢測波長的確立采用紫外分光光度計對阿霉素標準溶液、空白 PLA 微泡溶液進行掃描，結(jié)果見圖 2-1、圖 2-2。由掃描光譜可知，阿霉素的最大吸收波長為 480 nm。在 DOX 的最大吸收波長 480 nm 處，相應(yīng)濃度的空白 PLA 微泡溶液無干擾，故選定 480 nm 作為 DOX的檢測波長。
【學位授予單位】：佳木斯大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R943;R965

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本文編號：2660596