【摘要】：本課題設(shè)計了一種智能化的pH敏感免疫脂質(zhì)體(PDL),聯(lián)合應(yīng)用多西紫杉醇(docetaxel,DTX)介導(dǎo)的化學(xué)療法和PD-L1介導(dǎo)的腫瘤免疫療法來協(xié)同發(fā)揮高效的抗腫瘤效應(yīng)。對所制備脂質(zhì)體的理化性質(zhì)、釋藥行為、體外細(xì)胞毒性、體內(nèi)藥效學(xué)、體內(nèi)外安全性及其抗腫瘤機(jī)制進(jìn)行探究,為該制劑進(jìn)行臨床轉(zhuǎn)化,進(jìn)一步應(yīng)用于腫瘤治療提供理論及實驗基礎(chǔ)。具體研究內(nèi)容如下:(1)共載多西他賽和PD-L1抗體免疫脂質(zhì)體的制備、表征及釋藥行為考察通過薄膜水化法和后插入法成功制備載DTX脂質(zhì)體和共載DTX及PD-L1抗體的脂質(zhì)體,抗體與PEG通過酰胺結(jié)合的方式被修飾在脂質(zhì)體表面。TEM結(jié)果顯示脂質(zhì)體外觀圓整,分布均勻;DTX-LP和PDL的平均粒徑分別為113.6±2.991 nm和126.8±0.651 nm,PDI為0.252±0.005和0.232±0.010。在經(jīng)過抗體修飾后,平均粒徑上升,同時ζ電勢由-41.5±0.306上升至-31.5±0.961,初步表明抗體已成功連接至脂質(zhì)體表面。SDS-PAGE和共定位實驗進(jìn)一步證實脂質(zhì)體表面抗體的成功連接。HPLC法測定DTX-LP的包封率高達(dá)94.32±0.10%,載藥量約為5.91±0.001%。PDL包封率為91.39±1.09%,載藥量為4.49±0.042%。脂質(zhì)體表面較大的負(fù)電荷可幫助脂質(zhì)體載溶液中更加穩(wěn)定,并有效減少溶血現(xiàn)象的發(fā)生,具有較好的安全性和穩(wěn)定性。通過動態(tài)膜透析法對脂質(zhì)體的體外釋藥行為進(jìn)行研究,結(jié)果顯示在pH=7.4的中性條件下,DTX-LP和PDL都比游離藥物釋放速率要慢,在72h時累計釋放率才為57.99%和62.41%,明顯延長藥物釋放行為,保證了到達(dá)靶組織前脂質(zhì)體的穩(wěn)定性;而在pH5.0介質(zhì)中藥物能較快速地從脂質(zhì)體中釋放出來,72h釋放量可分別達(dá)86.80%和90.03%,DTX-LP和PDL的體外釋放具有明顯的pH敏感性,在靶向部位可快速釋放藥物。(2)免疫脂質(zhì)體的體外細(xì)胞毒性及靶向能力評價選取黑色素瘤B16-F10細(xì)胞為研究對象,在細(xì)胞水平研究各制劑的活性及功能。由于作用靶點是腫瘤細(xì)胞表面的PD-L1,首先通過流式細(xì)胞術(shù)驗證B16-F10細(xì)胞表面PD-L1的表達(dá)。通過CCK-8法測得空白載體細(xì)胞毒性低、生物相容性好。在給藥組中,細(xì)胞存活率不同給藥組中均存在時間依賴性和濃度依賴性。48 h時游離DTX、DTX-LP和PDL半數(shù)抑制濃度(IC50)分別為12.46μg/mL、6.60μg/mL和0.93μg/mL,DTX-LP和PDL的IC50分別相當(dāng)于游離藥物的0.52倍和0.07倍,充分表明當(dāng)主動靶向的脂質(zhì)體具有更高的細(xì)胞毒性。凋亡實驗結(jié)果也表明聯(lián)合遞送比單獨給藥擁有更強(qiáng)的凋亡誘導(dǎo)能力。DTX-LP和和PDL的凋亡誘導(dǎo)率分別為15.74±2.67%和26.17士3.71%明顯高于游離DTX的9.26±0.90%制劑的毒性隨著納米化和主動靶向增加。采用免疫熒光染色和流式探究脂質(zhì)體入胞機(jī)制和效率,結(jié)果顯示PDL的攝取高于DTX-LP則是由于B16-F10細(xì)胞表而存在PD-L1,PDL的主動靶向能力使其更多的富集于胞內(nèi)。競爭性實驗也進(jìn)一步驗證其靶向能力是由PD-L1所介導(dǎo)。因此可初步推論,主動靶向脂質(zhì)體能夠顯著提高藥效,幫助藥物更多的富集于靶部位發(fā)揮作用。(3)免疫脂質(zhì)體的體內(nèi)藥效學(xué)及主動靶向能力研究將B16-F10黑色素瘤細(xì)胞接種于小鼠皮下,構(gòu)建小鼠原位黑色素瘤模型,在動物水平檢驗不同藥物和脂質(zhì)體的相關(guān)藥效學(xué)性質(zhì)及靶向能力。采用脂質(zhì)小分子熒光探針DiR替代DTX制備相應(yīng)的脂質(zhì)體(DiR-LP和DiR-PDL),通過使用近紅外活體成像系統(tǒng)可實時監(jiān)測游離藥物或載體在體內(nèi)的生物分布行為。所制備的DiR-PDL在體內(nèi)觀測和離體成像的腫瘤組織中均表現(xiàn)出更多富集,而在游離藥物組中幾乎檢測不到腫瘤組織分布。DiR-PDL和DiR-LP在腫瘤組織的積累分別比游離藥物高11.98倍和3.95倍,說明免疫脂質(zhì)體可以有效地靶向腫瘤組織,從而減少副作用。體內(nèi)藥效學(xué)結(jié)果顯示PDL具有最強(qiáng)的療效,小鼠生存時間明顯延長,且未造成小鼠體重降低。腫瘤組織切片TUNEL免疫熒光和Ki67免疫組化染色與藥效學(xué)結(jié)果相符,PDL組的陽性率分別為58.81±14.16%和65.95±3.5%。充分驗證免疫化學(xué)療法可增強(qiáng)抗腫瘤免疫,同時有效殺傷腫瘤細(xì)胞來抑制腫瘤生長和延長小鼠存活率。(4)免疫脂質(zhì)體的安全性評價及初步機(jī)制研究考察脂質(zhì)體的安全性及抗腫瘤作用機(jī)制,為其臨床轉(zhuǎn)化提供數(shù)據(jù)支持和理論依據(jù)。通過測定肝功能指標(biāo)ALT和AST及腎功能指標(biāo)BUN的水平來間接評估藥物的安全性。結(jié)果顯示各參數(shù)均在正常范圍內(nèi),初步表明制劑未對肝腎產(chǎn)生明顯實質(zhì)損傷。主要器官組織病理學(xué)檢查顯示,除游離藥物組合外,各組織切片形態(tài)未表現(xiàn)出明顯的病理異常。表明游離藥物組合存在相對嚴(yán)重的全身毒性。進(jìn)一步驗證PDL可降低副作用。同時,通過免疫熒光染色對抗腫瘤免疫機(jī)制作初步探討,PDL組可觀察到腫瘤組織中富集最多的TILs和的顆粒酶B,表明免疫脂質(zhì)體可促進(jìn)體內(nèi)TILs的募集和毒性。因此可推斷PDL通過關(guān)閉PD-1/PD-L1途徑引發(fā)CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)的強(qiáng)效腫瘤細(xì)胞殺傷,與DTX的細(xì)胞毒性協(xié)同產(chǎn)生強(qiáng)力抗腫瘤作用,同時具有良好的安全性和應(yīng)用前景。
【圖文】：

逑變導(dǎo)致膠質(zhì)細(xì)胞瘤中的ＰＩ３Ｋ－ＡＫＴ通路激活３°，而９ｐ２４．邋１基因在某些淋巴瘤中逡逑的易位或擴(kuò)增３１’３２，最終可導(dǎo)致ＰＤＬ１在大多數(shù)腫瘤細(xì)胞表面廣泛表達(dá)（圖１）。逡逑ＰＤ－Ｌ１邐，／＇１邋ｌｎｎａ，ｅ邋＿逡逑？Ｑ邋－＾—邋ｒ－／／邋！逡逑一邋Ｐｉ．＼邐ＴＵｍｏｒｃｅ，，邋Ｕ邋邐：曼邐：逡逑＾！邋－＾４＾，邋Ｊｊ＾ｙ邋＜－：：－邋－■逡逑？邋：y�，（八，－音－，０櫫x希獺蓿危荊澹觥瑰危擼澹悖幌﹀義�、一人NB逡逑圖１腫瘤內(nèi)部ＰＤＬｌ表達(dá)的機(jī)制。腫瘤細(xì)胞的ＰＤＬｌ的組成型廣泛（先天）逡逑表達(dá)被認(rèn)為是由失調(diào)的信號傳導(dǎo)途徑或染色體改變和擴(kuò)增驅(qū)動的。腫瘤細(xì)胞和巨逡逑噬細(xì)胞的ＰＤＬ１的局部表達(dá)發(fā)生在腫瘤細(xì)胞群表面，同時分泌促炎因子如干擾素逡逑－ｙ邋（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ，，邋ＩＦＮ－ｙ）＝邋ＰＤＬｌ與ＰＤ１分子的連接將下調(diào)Ｔ細(xì)胞功能，產(chǎn)生抑逡逑制抗腫瘤免疫的負(fù)反饋結(jié)果。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１邋Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ邋ｆｏｒ邋ｉｎｔｒａｔｕｍｏｒａｌ邋ＰＤＬｌ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．邋Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ邋ｂｒｏａｄ逡逑（ｉｎｎａｔｅ）邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｏｆ邋ｍｅｍｂｒａｎｏｕｓ邋ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ邋ｃｅｌｌ邋ｄｅａｔｈ邋１邋ｌｉｇａｎｄ邋１邋（ＰＤＬｌ）邋ｂｙ逡逑ｔｕｍｏｒ邋ｃｅｌｌｓ邋ｉｓ邋ｔｈｏｕｇｈｔ邋ｔｏ邋ｂｅ邋ｄｒｉｖｅｎ邋ｂｙ邋ｄｙｓｒｅｇｕｌａｔｅｄ邋ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ邋ｐａｔｈｗａｙｓ

４．１設(shè)計思路逡逑近來研究者普遍認(rèn)為某些化療可以與免疫療法協(xié)同作用，從而改善療效和預(yù)逡逑后。本課題設(shè)計了一種智能化的ｐＨ敏感免疫脂質(zhì)體（ＰＤＬ），選擇二油酰磷脂酰逡逑乙醇胺（ＤＯＰＥ）和大豆卵磷脂（ＳＰＣ）為磷脂雙分子層的基礎(chǔ)材料，琥珀酸膽固醇逡逑單酯（ＣＨＥＭＳ）為ｐＨ敏感材料，該系統(tǒng)以ｐＨ敏感性脂質(zhì)體為基礎(chǔ)，雙分子層內(nèi)逡逑負(fù)載化療藥物多西他賽；脂質(zhì)體外層ＰＥＧ鏈上接ＰＤ－Ｌ１單克隆抗體（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ逡逑ａｎｔｉｂｏｄｙ，邋ｍＡｂ）。在脂質(zhì)體表面修飾的ＰＤ－Ｌ１邋ｍＡｂ，可以準(zhǔn)確地耙向腫瘤細(xì)胞，關(guān)逡逑閉免疫抑制性的ＰＤ１／ＰＤ－Ｌ１通路，同時ＤＴＸ可直接殺傷腫瘤細(xì)胞。通過薄膜水逡逑化法制備脂質(zhì)體，聯(lián)合應(yīng)用多西他賽（ｄｏｃｅｔａｘｅｌ，ＤＴＸ）介導(dǎo)的化學(xué)療法和ＰＤ－Ｌ１逡逑介導(dǎo)的腫瘤免疫療法來協(xié)同發(fā)揮高效的抗腫瘤效應(yīng)。對所制備脂質(zhì)體的理化性質(zhì)、逡逑體內(nèi)外釋藥行為、體外細(xì)胞毒性、體內(nèi)藥效學(xué)、體內(nèi)外安全性及其抗腫瘤機(jī)制進(jìn)逡逑行探究，為該制劑后續(xù)臨床轉(zhuǎn)化，進(jìn)一步應(yīng)用于腫瘤治療提供理論及實驗基礎(chǔ)。逡逑
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R943

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