【摘要】：肝轉(zhuǎn)移是結(jié)腸癌致死的主要原因,常采用肝切除術(shù)和化學(xué)藥物治療。肝切除術(shù)適用范圍窄,化學(xué)藥物脫靶現(xiàn)象嚴(yán)重,副作用大,療效不明顯,因此探索靶向藥物治療方法對(duì)結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移的治療發(fā)展具有重要意義。事實(shí)上,轉(zhuǎn)移引發(fā)的細(xì)胞受體數(shù)量變化、侵襲能力增加以及扭曲血管等都有可能導(dǎo)致化學(xué)藥物脫靶現(xiàn)象的發(fā)生。本研究旨在探索結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移灶與原位瘤受體數(shù)量差異的基礎(chǔ)上,構(gòu)建靶向藥物遞釋系統(tǒng),通過(guò)增加轉(zhuǎn)移灶細(xì)胞內(nèi)的藥物濃度,實(shí)現(xiàn)結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移的有效治療。α5β1整合素是一種侵襲性結(jié)腸癌細(xì)胞表面高表達(dá)的脂蛋白受體,與結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移過(guò)程密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移灶細(xì)胞表面α5β1整合素表達(dá)量顯著高于原位瘤細(xì)胞。肝轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞劃痕愈合率和侵襲基質(zhì)膜的能力都明顯強(qiáng)于原位腫瘤細(xì)胞。Western blot研究結(jié)果顯示,在肝轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞上,基質(zhì)金屬蛋白酶-9(Matrix metalloproteinases-9,MMP-9)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)蛋白表達(dá)量明顯增強(qiáng)。脾內(nèi)注射法評(píng)價(jià)腫瘤細(xì)胞增殖能力,相同時(shí)間內(nèi),轉(zhuǎn)移灶腫瘤細(xì)胞增殖速度快于原位腫瘤細(xì)胞。研究結(jié)果表明,轉(zhuǎn)移灶腫瘤細(xì)胞的侵襲能力強(qiáng)于原位瘤細(xì)胞。研究中發(fā)現(xiàn)的肝轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞較原位腫瘤細(xì)胞具有更高的α5β1整合素受體表達(dá)量,以及更強(qiáng)的侵襲能力,為靶向轉(zhuǎn)移灶藥物遞釋系統(tǒng)的有效設(shè)計(jì),提供理論依據(jù)。本研究以低分子量海洋生物材料殼聚糖為基本骨架,碳二亞胺為橋鏈劑,酰胺縮合反應(yīng)制備殼聚糖硬脂酸嫁接物(Chitosan oligosaccharide-g-stearic acid,CSOS A)。以碳二亞胺/N-羥基琥珀酰亞胺為交聯(lián)偶合劑,N,N'-二琥珀酰亞胺基碳酸酯為橋鏈劑,合成表面經(jīng)RPM多肽修飾的殼聚糖硬脂酸嫁接物(RPM peptide modified chitosan oligosaccharide-g-stearic acid,RPM-CSOSA)。在水性介質(zhì)中,CSOSA 和RPM-CSOSA嫁接物可自聚集形成膠束,臨界膠束濃度分別為79.4μg/mL和94.6μg/mL。微粒粒度與表面電位儀測(cè)得CSOSA和RPM-CSOSA嫁接物膠束數(shù)均粒徑分別為 68.5±0.5nm 和 76.4±2.9nm,電位分別為 27.4±0.35 和 17.1±0.14mV,透射電鏡照片顯示膠束成類球型,粒徑分布均勻。阿霉素(Doxorubicin,DOX)是一種廣譜的蒽環(huán)類細(xì)胞毒藥物。姜黃素(Curcumin,CUR)是從植物姜黃根莖中提取的多酚類藥物,臨床上多用作抗癌增敏劑。研究表明,阿霉素和姜黃素聯(lián)合應(yīng)用可有效增加細(xì)胞內(nèi)藥物濃度,抑制多藥耐藥,提高抗腫瘤藥效。本研究分別選用阿霉素、姜黃素,透析法制備納米給藥系統(tǒng) RPM-CSOSA/DOX 和 RPM-CSOSA/CUR,藥物包封率分別為 86.5%和 45.9%。在PBS(pH 5.0)條件下,進(jìn)行納米給藥系統(tǒng)的釋放動(dòng)力學(xué)研究,與CSOSA納米給藥系統(tǒng)相比,72h內(nèi)RPM-CSOSA納米給藥系統(tǒng)緩慢釋放包封的阿霉素達(dá)54.7%,姜黃素的累積釋放量達(dá)53.2%。激光共聚焦顯微鏡研究結(jié)果表明,RPM-CSOSA膠束通過(guò)α5βi整合素受體介導(dǎo)的方式,增加在HT29細(xì)胞和HUVEC細(xì)胞的攝取,且RPM多肽的修飾增強(qiáng)了膠束對(duì)HT29細(xì)胞的特異性攝取,減少對(duì)正常細(xì)胞的毒副作用。體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)篩選阿霉素與姜黃素最佳協(xié)同比例為1:2(w/w)。按上述1:2(w/w)構(gòu)建聯(lián)合靶向給藥系統(tǒng)(RPM-CSOSA/DOXRPM-CSOSA/CUR),人結(jié)腸癌細(xì)胞HT29和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC的IC50值,分別為0.81μg/mL和2.62μg/mL,明顯低于聯(lián)合非靶向給藥系統(tǒng)(CSOSA/DOXCSOSA/CUR),DOXCUR組。細(xì)胞周期分析顯示,阿霉素和姜黃素聯(lián)合應(yīng)用可將細(xì)胞阻滯在G2/M期,聯(lián)合靶向給藥系統(tǒng)的阻滯作用最為明顯。體外劃痕實(shí)驗(yàn)和侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,聯(lián)合靶向給藥系統(tǒng)能夠顯著抑制腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲能力。通過(guò)脾內(nèi)注射HT29細(xì)胞構(gòu)建結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型,FITC標(biāo)記的RPM-CSOSA肝轉(zhuǎn)移灶分布結(jié)果表明,RPM多肽修飾能夠增加膠束在轉(zhuǎn)移灶腫瘤細(xì)胞的分布。模型動(dòng)物抗肝轉(zhuǎn)移藥效學(xué)研究結(jié)果顯示,等劑量的聯(lián)合靶向給藥系統(tǒng)抑制結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移率為87.0%,是聯(lián)合非靶向給藥系統(tǒng)治療組的1.3倍。免疫組化研究結(jié)果顯示,與DOX,DOXCUR,聯(lián)合非靶向給藥系統(tǒng)治療組相比,聯(lián)合靶向給藥系統(tǒng)治療組的肝轉(zhuǎn)移灶處腫瘤血管密度明顯降低。本研究結(jié)果表明,根據(jù)肝轉(zhuǎn)移灶細(xì)胞與原位瘤細(xì)胞受體數(shù)量差異,設(shè)計(jì)多肽修飾的納米藥物遞送系統(tǒng),具有較好的肝轉(zhuǎn)移細(xì)胞靶向性,增強(qiáng)轉(zhuǎn)移灶細(xì)胞的藥物分布,提高療效。同時(shí),阿霉素和姜黃素兩藥的聯(lián)合使用,進(jìn)一步增強(qiáng)靶向制劑的抗轉(zhuǎn)移藥效,該主動(dòng)靶向納米給藥系統(tǒng)的設(shè)計(jì),為結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移治療提供了新的思路。
【圖文】：

１．３．１肝轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞表面ａｓｐ，整合素表達(dá)量的測(cè)定逡逑Ｗｅｓｔｅｍｂｌｏｔ法測(cè)定原位胖瘤細(xì)胞與肝轉(zhuǎn)移灶腫瘤細(xì)胞表面ａ５Ｐｉ整合素表達(dá)量，逡逑結(jié)果如圖１．１所示，肝轉(zhuǎn)移灶腫瘤細(xì)胞表面ａｓＰｉ整合素表達(dá)量顯著高于原位腫瘤逡逑細(xì)胞。整合素是由ａ、Ｐ亞單位構(gòu)成的糖蛋白受體，與腫瘤血管生成、侵襲、遷移逡逑和轉(zhuǎn)移等相關(guān)［５］。其中，０１５＾整合素是一類在侵襲性結(jié)腸癌細(xì)胞表面高表達(dá)、與纖逡逑連蛋白結(jié)合的受體［６，７］。研究表明，0１出１整合素通過(guò)調(diào)節(jié)黏著斑激酶的磷酸化，，增逡逑強(qiáng)腫瘤細(xì)胞與肝細(xì)胞外基質(zhì)的黏附作用，促進(jìn)結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移［２４】。與原位瘤相比，本逡逑研究確認(rèn)轉(zhuǎn)移灶腫瘤細(xì)胞表面ａｓｈ整合素具有高表達(dá)特征，提示ａｓｐ，整合素配體逡逑修飾的給藥系統(tǒng)，具有靶向轉(zhuǎn)移灶腫瘤細(xì)胞的潛在可行性。逡逑ｉ邐ｉｉ逡逑Ｉｎｔｅｇｒｉｎ邋ｐ１逡逑－邐＾＾邐ＭＭＰ－９逡逑ＶＥＧＦ逡逑ｐ－ａｃｔｉｎ逡逑圖１．１原位瘤ＨＴ２９細(xì)胞（ｉ）和轉(zhuǎn)移灶ＨＴ２９細(xì)胞（ｉｉ）表面Ｐ！整合素和轉(zhuǎn)移相關(guān)逡逑蛋白灰度處理圖逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１．１邋Ｉｍａｇｅｓ邋ｏｆ邋ｉｎｔｅｇｒｉｎ邋Ｐｉ，邋ＭＭＰ－９，

劃痕法評(píng)價(jià)肝轉(zhuǎn)移灶結(jié)腸癌細(xì)胞遷移能力。體外培養(yǎng)形成的單層細(xì)胞膜，ｌ0ＨＬ逡逑移液槍槍頭劃痕致傷，因自身具有遷移能力，劃痕兩側(cè)腫瘤細(xì)胞會(huì)向中心遷移。觀逡逑察Ｏｈ和４８ｈ的劃痕寬度，Ｉｍａｇｅ邋Ｊ計(jì)算腫瘤細(xì)胞的劃痕徖移率。結(jié)果如圖１．２所逡逑示，４８ｈ內(nèi)肝轉(zhuǎn)移灶ＣＴ２６細(xì)胞的遷移率是原位瘤ＣＴ２６細(xì)胞的２．６倍。劃痕遷移逡逑率越高
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R943;R96

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 陳云艷;瞿鼎;郭夢(mèng)斐;秦越;陳彥;;抗腫瘤中藥納米給藥系統(tǒng)的研究進(jìn)展[J];世界科學(xué)技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化;2018年03期

2 羅小林;易丹丹;;抗腫瘤藥物納米給藥系統(tǒng)研究進(jìn)展[J];醫(yī)藥導(dǎo)報(bào);2015年02期

3 王麗f

本文編號(hào)：2652706