【摘要】：肝轉移是結腸癌致死的主要原因,常采用肝切除術和化學藥物治療。肝切除術適用范圍窄,化學藥物脫靶現(xiàn)象嚴重,副作用大,療效不明顯,因此探索靶向藥物治療方法對結腸癌肝轉移的治療發(fā)展具有重要意義。事實上,轉移引發(fā)的細胞受體數(shù)量變化、侵襲能力增加以及扭曲血管等都有可能導致化學藥物脫靶現(xiàn)象的發(fā)生。本研究旨在探索結腸癌肝轉移灶與原位瘤受體數(shù)量差異的基礎上,構建靶向藥物遞釋系統(tǒng),通過增加轉移灶細胞內的藥物濃度,實現(xiàn)結腸癌肝轉移的有效治療。α5β1整合素是一種侵襲性結腸癌細胞表面高表達的脂蛋白受體,與結腸癌肝轉移過程密切相關。本研究發(fā)現(xiàn)肝轉移灶細胞表面α5β1整合素表達量顯著高于原位瘤細胞。肝轉移腫瘤細胞劃痕愈合率和侵襲基質膜的能力都明顯強于原位腫瘤細胞。Western blot研究結果顯示,在肝轉移腫瘤細胞上,基質金屬蛋白酶-9(Matrix metalloproteinases-9,MMP-9)和血管內皮生長因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)蛋白表達量明顯增強。脾內注射法評價腫瘤細胞增殖能力,相同時間內,轉移灶腫瘤細胞增殖速度快于原位腫瘤細胞。研究結果表明,轉移灶腫瘤細胞的侵襲能力強于原位瘤細胞。研究中發(fā)現(xiàn)的肝轉移腫瘤細胞較原位腫瘤細胞具有更高的α5β1整合素受體表達量,以及更強的侵襲能力,為靶向轉移灶藥物遞釋系統(tǒng)的有效設計,提供理論依據(jù)。本研究以低分子量海洋生物材料殼聚糖為基本骨架,碳二亞胺為橋鏈劑,酰胺縮合反應制備殼聚糖硬脂酸嫁接物(Chitosan oligosaccharide-g-stearic acid,CSOS A)。以碳二亞胺/N-羥基琥珀酰亞胺為交聯(lián)偶合劑,N,N'-二琥珀酰亞胺基碳酸酯為橋鏈劑,合成表面經(jīng)RPM多肽修飾的殼聚糖硬脂酸嫁接物(RPM peptide modified chitosan oligosaccharide-g-stearic acid,RPM-CSOSA)。在水性介質中,CSOSA 和RPM-CSOSA嫁接物可自聚集形成膠束,臨界膠束濃度分別為79.4μg/mL和94.6μg/mL。微粒粒度與表面電位儀測得CSOSA和RPM-CSOSA嫁接物膠束數(shù)均粒徑分別為 68.5±0.5nm 和 76.4±2.9nm,電位分別為 27.4±0.35 和 17.1±0.14mV,透射電鏡照片顯示膠束成類球型,粒徑分布均勻。阿霉素(Doxorubicin,DOX)是一種廣譜的蒽環(huán)類細胞毒藥物。姜黃素(Curcumin,CUR)是從植物姜黃根莖中提取的多酚類藥物,臨床上多用作抗癌增敏劑。研究表明,阿霉素和姜黃素聯(lián)合應用可有效增加細胞內藥物濃度,抑制多藥耐藥,提高抗腫瘤藥效。本研究分別選用阿霉素、姜黃素,透析法制備納米給藥系統(tǒng) RPM-CSOSA/DOX 和 RPM-CSOSA/CUR,藥物包封率分別為 86.5%和 45.9%。在PBS(pH 5.0)條件下,進行納米給藥系統(tǒng)的釋放動力學研究,與CSOSA納米給藥系統(tǒng)相比,72h內RPM-CSOSA納米給藥系統(tǒng)緩慢釋放包封的阿霉素達54.7%,姜黃素的累積釋放量達53.2%。激光共聚焦顯微鏡研究結果表明,RPM-CSOSA膠束通過α5βi整合素受體介導的方式,增加在HT29細胞和HUVEC細胞的攝取,且RPM多肽的修飾增強了膠束對HT29細胞的特異性攝取,減少對正常細胞的毒副作用。體外細胞毒性實驗篩選阿霉素與姜黃素最佳協(xié)同比例為1:2(w/w)。按上述1:2(w/w)構建聯(lián)合靶向給藥系統(tǒng)(RPM-CSOSA/DOXRPM-CSOSA/CUR),人結腸癌細胞HT29和人臍靜脈內皮細胞HUVEC的IC50值,分別為0.81μg/mL和2.62μg/mL,明顯低于聯(lián)合非靶向給藥系統(tǒng)(CSOSA/DOXCSOSA/CUR),DOXCUR組。細胞周期分析顯示,阿霉素和姜黃素聯(lián)合應用可將細胞阻滯在G2/M期,聯(lián)合靶向給藥系統(tǒng)的阻滯作用最為明顯。體外劃痕實驗和侵襲實驗結果表明,聯(lián)合靶向給藥系統(tǒng)能夠顯著抑制腫瘤細胞遷移和侵襲能力。通過脾內注射HT29細胞構建結腸癌肝轉移動物模型,FITC標記的RPM-CSOSA肝轉移灶分布結果表明,RPM多肽修飾能夠增加膠束在轉移灶腫瘤細胞的分布。模型動物抗肝轉移藥效學研究結果顯示,等劑量的聯(lián)合靶向給藥系統(tǒng)抑制結腸癌肝轉移率為87.0%,是聯(lián)合非靶向給藥系統(tǒng)治療組的1.3倍。免疫組化研究結果顯示,與DOX,DOXCUR,聯(lián)合非靶向給藥系統(tǒng)治療組相比,聯(lián)合靶向給藥系統(tǒng)治療組的肝轉移灶處腫瘤血管密度明顯降低。本研究結果表明,根據(jù)肝轉移灶細胞與原位瘤細胞受體數(shù)量差異,設計多肽修飾的納米藥物遞送系統(tǒng),具有較好的肝轉移細胞靶向性,增強轉移灶細胞的藥物分布,提高療效。同時,阿霉素和姜黃素兩藥的聯(lián)合使用,進一步增強靶向制劑的抗轉移藥效,該主動靶向納米給藥系統(tǒng)的設計,為結腸癌肝轉移治療提供了新的思路。
【圖文】：

１．３．１肝轉移腫瘤細胞表面ａｓｐ，整合素表達量的測定逡逑Ｗｅｓｔｅｍｂｌｏｔ法測定原位胖瘤細胞與肝轉移灶腫瘤細胞表面ａ５Ｐｉ整合素表達量，逡逑結果如圖１．１所示，肝轉移灶腫瘤細胞表面ａｓＰｉ整合素表達量顯著高于原位腫瘤逡逑細胞。整合素是由ａ、Ｐ亞單位構成的糖蛋白受體，與腫瘤血管生成、侵襲、遷移逡逑和轉移等相關［５］。其中，０１５＾整合素是一類在侵襲性結腸癌細胞表面高表達、與纖逡逑連蛋白結合的受體［６，７］。研究表明，0１出１整合素通過調節(jié)黏著斑激酶的磷酸化，，增逡逑強腫瘤細胞與肝細胞外基質的黏附作用，促進結腸癌肝轉移［２４】。與原位瘤相比，本逡逑研究確認轉移灶腫瘤細胞表面ａｓｈ整合素具有高表達特征，提示ａｓｐ，整合素配體逡逑修飾的給藥系統(tǒng)，具有靶向轉移灶腫瘤細胞的潛在可行性。逡逑ｉ邐ｉｉ逡逑Ｉｎｔｅｇｒｉｎ邋ｐ１逡逑－邐＾＾邐ＭＭＰ－９逡逑ＶＥＧＦ逡逑ｐ－ａｃｔｉｎ逡逑圖１．１原位瘤ＨＴ２９細胞（ｉ）和轉移灶ＨＴ２９細胞（ｉｉ）表面Ｐ！整合素和轉移相關逡逑蛋白灰度處理圖逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１．１邋Ｉｍａｇｅｓ邋ｏｆ邋ｉｎｔｅｇｒｉｎ邋Ｐｉ，邋ＭＭＰ－９，

劃痕法評價肝轉移灶結腸癌細胞遷移能力。體外培養(yǎng)形成的單層細胞膜，ｌ0ＨＬ逡逑移液槍槍頭劃痕致傷，因自身具有遷移能力，劃痕兩側腫瘤細胞會向中心遷移。觀逡逑察Ｏｈ和４８ｈ的劃痕寬度，Ｉｍａｇｅ邋Ｊ計算腫瘤細胞的劃痕徖移率。結果如圖１．２所逡逑示，４８ｈ內肝轉移灶ＣＴ２６細胞的遷移率是原位瘤ＣＴ２６細胞的２．６倍。劃痕遷移逡逑率越高
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R943;R96

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2 羅小林;易丹丹;;抗腫瘤藥物納米給藥系統(tǒng)研究進展[J];醫(yī)藥導報;2015年02期

3 王麗f

本文編號：2652706