【摘要】：背景:Hedgehog(Hh)信號通路在哺乳動物的生長發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用,Hh通路的異常表達也被證明與多種癌癥的產(chǎn)生有關(guān)。在臨床實驗中,抑制異常表達的Hh通路已被證明是一種對抗基底細胞癌(BCC)、髓母細胞瘤(MB)等癌癥的有前途的治療干預(yù)手段。而在Hh通路中Smo蛋白被廣泛的選擇作為抑制Hh通路異常表達的靶點,多種以Smo蛋白為靶點的藥物與抑制劑已被研發(fā)。目的:目前,已經(jīng)有兩個Hh靶向藥物(Vismodegib,Sonidegib)被批準用于治療基底細胞癌,更多的抑制劑正在臨床研究中。但是,已經(jīng)上市的化合物在臨床治療中均產(chǎn)生了很強的副作用以及發(fā)現(xiàn)了耐藥性的現(xiàn)象。因此,開發(fā)新型能夠克服耐藥作用的Hh通路抑制劑具有非常重要的意義。在此,我們課題組利用復(fù)旦大學趙偉利和董肖椿課題組合成的化合物,使用多種體外和體內(nèi)模型系統(tǒng)鑒定一種新的、耐受良好、具有口服活性的小分子Hh抑制劑。方法與結(jié)果:在本研究中,采用Dual-Luciferase Assay Reporter System,篩選了61種含有酞嗪或二甲基噠嗪中心骨架的合成化合物作為新的Hh信號傳導抑制劑的候選物。在這些化合物中,L-4抑制作用最強,IC_(50)值為2.23 nM。Brdu法檢測細胞增殖,L-4對原代髓母細胞具有很強的生長抑制作用,IC_(50)為31.36 nM,而陽性藥Vismodegib和LY-2940680的IC_(50)值分別為37.65 and 35.5 nM,表明L-4具有和陽性藥相似的增殖抑制作用。Western Blot顯示L-4在體外強烈抑制Hh途徑,對原代髓母細胞瘤和Shh-Light II細胞,300 nM的L-4就可以顯著抑制Gli1蛋白和Ptch1蛋白。BODIPY-cyclopamine競爭結(jié)合實驗證明L-4通過拮抗Smo以阻斷Hh途徑,當L-4濃度達到1μM時就可以競爭拮抗50%相同濃度的熒光環(huán)巴胺與Smo的結(jié)合,表明L-4和第一代Hh通路抑制劑環(huán)巴胺有相似結(jié)合Smo蛋白的能力。有意義的是,L-4可顯著抑制Smo突變體(D473H)引起的Hh通路活性,L-4作用于轉(zhuǎn)染了野生型和突變型Smo質(zhì)粒的Shh-Light II細胞,IC_(50)值分別為23.46和24.55 nM,基本保持一致。而上市藥物Vismodegib對轉(zhuǎn)染野生型和突變型Smo質(zhì)粒的Shh-Light II細胞的IC_(50)值分別為21.63和326.8 nM,差距達到15倍之多。分子docking實驗同樣驗證了體外抗耐藥實驗的結(jié)果。動物實驗方面,口服給藥的L-4在Ptch+/-;p53-/-轉(zhuǎn)基因髓母細胞瘤同種異體移植模型中表現(xiàn)出顯著的劑量依賴性抗腫瘤功效,最低劑量的5 mg/kg就有明顯的抗腫瘤增殖作用。口服20 mg/kg的L-4之后,腫瘤幾乎停止生長,治療效果與陽性藥LY-2940680相當。此外,L-4在使用ICR小鼠的急性毒性試驗中顯示出良好的耐受性,一次性口服2000 mg/kg的劑量沒有產(chǎn)生明顯的毒副作用。結(jié)論:本研究應(yīng)用Dual-Luciferase Assay Reporter System篩選出了具有顯著Hh信號通路抑制活性的化合物L-4。L-4通過拮抗Smo受體強烈抑制Hh通路,降低Gli1和Ptch1的表達,進而抑制腫瘤生長。L-4在抗耐藥方面超越目前處于臨床使用的藥物。在Ptch+/-;p53-/-髓母細胞瘤移植模型的體內(nèi)實驗中,口服L-4表現(xiàn)出顯著的抗腫瘤功效,并且L-4表現(xiàn)出良好的耐受性。我們的研究結(jié)果表明,L-4是一種新型靶向Smo蛋白的Hh通路抑制劑,具有抑制髓母細胞瘤活性強、耐受良好、口服有效和抗耐藥性等特點。尤其是克服耐藥性方面,在細胞水平L-4比上市藥物擁有高10倍抑制突變Smo蛋白的能力,這使得L-4成為具有更好治療效果的Hh抑制劑,是一個很有開發(fā)前景的Hh靶向抗腫瘤藥物。如能進一步完成L-4的臨床前與臨床研究,有望解決目前上市藥物治療后產(chǎn)生的耐藥性與毒副作用問題,成為接替Vismodegib和Sonidegib的二線新型Hh靶向抗腫瘤藥物。
【學位授予單位】：華東師范大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R96

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