【摘要】：脂肪酶(lipase E.C.3.1.1.3)也稱(chēng)為三酰基甘油酰基水解酶,幾乎普遍存在于生物界中的每一個(gè)角落。作為生命體活動(dòng)的重要代謝酶,所有的脂肪酶都屬于絲氨酸水解酶,它們?cè)诮Y(jié)構(gòu)上都具有一個(gè)保守的五肽,使得所有脂肪酶雖序列差異大仍能夠催化相同反應(yīng)的發(fā)生。脂肪酶抑制劑則是能夠抑制脂肪酶活性的物質(zhì),因此他們能夠使膳食脂肪在分解反應(yīng)的過(guò)程中受到抑制,減少人體對(duì)脂肪的吸收,從而控制和治療肥胖的作用。這是目前治療肥胖最主要的策略,即開(kāi)發(fā)營(yíng)養(yǎng)消化吸收抑制劑,如臨床唯一批準(zhǔn)的治療肥胖藥物奧利司他(Orlista)。然而,長(zhǎng)期服用該藥物卻會(huì)引發(fā)一系列副作用。因而,尋求低毒、高效的脂肪酶抑制劑成為一大研究熱點(diǎn)。本研究中以米黑毛霉脂肪酶(Mucor miehei Lipase,MML)為研究對(duì)象,研究其催化長(zhǎng)鏈脂肪酸�；ブ械膶�(duì)硝基苯酚棕櫚酸酯(4-Nitrophenyl palmitate,p-PNC16)水解反應(yīng)的酶學(xué)性質(zhì)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,MML催化底物p-NPC16水解反應(yīng)最適溫度35 ℃,最適反應(yīng)pH在7.8-8.2之間,且該酶在pH 8.0-9.0和30-40 ℃范圍內(nèi)具有較高的酶活力。該酶催化底物p-NPC16水解的動(dòng)力學(xué)參數(shù)米氏常數(shù)Km和最大速度Vm分別為0.59 mmol/L和24.69 μmol/L/min。測(cè)定的16種常見(jiàn)金屬離子及其酸根離子在一定濃度(1-10 mmol/L)內(nèi)對(duì)該反應(yīng)的影響,結(jié)果表明Li+、Na+、K+、SO42-、Cl-、NO3-對(duì)米黑毛霉脂肪酶活力幾乎不影響,而Mg2+、Ca2+、Ba2+和Mn2+在離子濃度達(dá)到1.0mmol/L下,分別讓酶活力提高 64.2%、51.3%、116.2%和 218.7%。Fe3+、A13+、Zn2+、Hg2+和Cu2+具有抑制酶活力的作用,離子濃度為1.0mmol/L時(shí),分別使酶活力下降了88.5%、82.7%、8.9%、71.2%和 22.9%。此外,本研究還重點(diǎn)研究了沒(méi)食子酸(G)、表兒茶素(EC)、表沒(méi)食子酸兒茶素(EGC)和表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(EGCG)四種酚類(lèi)物質(zhì)對(duì)MML的抑制作用。選取的四種酚類(lèi)物質(zhì)在結(jié)構(gòu)上具有一定相似性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,四種效應(yīng)物均具有較為顯著的抑制作用。G、EC、EGC和EGCG對(duì)應(yīng)的IC50分別為1.29,0.23,0.026,0.017 mmol/L。G對(duì)酶表現(xiàn)出非競(jìng)爭(zhēng)型抑制,抑制常數(shù)為1.29 mmol/L;EC、EGC和EGCG則表現(xiàn)為混合型抑制,其抑制常數(shù)依次為,0.146 mmol/L 和 0.375 mmol/L,0.014 mmol/L 和 0.057 mmol/L,0.012 mmol/L 和 0.039 mmol/L。建立在前面的研究基礎(chǔ)上,探究四種效應(yīng)物對(duì)MML的失活、抑制作用動(dòng)力學(xué),建立其抑制模型、測(cè)定微觀速度常數(shù),其中G對(duì)MML的為非競(jìng)爭(zhēng)型,說(shuō)明酶與底物、G可逆地獨(dú)立地結(jié)合成無(wú)活性的三元復(fù)合物。測(cè)定的兒茶素類(lèi)化合物對(duì)游離酶的失活速度常數(shù)比酶-底物復(fù)合物的失活速度常數(shù)大,說(shuō)明底物對(duì)MML具有保護(hù)作用。四種效應(yīng)物皆能夠和MML相結(jié)合,導(dǎo)致酶活性降低。MOE模擬效應(yīng)物與MML的結(jié)合,酶蛋白與小分子配體之間的結(jié)合能力由大到小依次是EGCG、EGC、EC和G,它們皆能影響MML活性中心的重要氨基酸殘基。熒光淬滅也呈現(xiàn)出一致的結(jié)果,即對(duì)酶抑制能力最強(qiáng)的EGCG與MML的結(jié)合常數(shù)(KA)和結(jié)合位點(diǎn)(n)高于EGC。綜上,本論文一方面以對(duì)米黑毛霉脂肪酶催化底物p-PNC16相關(guān)酶學(xué)性質(zhì)的研究建立了脂肪酶抑制劑篩選的測(cè)活體系,可應(yīng)用于后續(xù)的天然來(lái)源的脂肪酶抑制劑和化學(xué)合成抑制劑的篩選。另一方面比較研究了四種酚類(lèi)效應(yīng)物對(duì)米黑毛霉脂肪酶的抑制作用,并探討了效應(yīng)物抑制作用與其結(jié)構(gòu)的潛在聯(lián)系,為脂肪酶抑制劑的篩選和合成提供了理論依據(jù)。
【圖文】：

幾乎存在于生物界中的每一個(gè)角落，比如微生物中的細(xì)菌［１８］、霉菌［１９］和動(dòng)植物逡逑中，如哺乳動(dòng)物［２（）］、植物［２１］，是生命體活動(dòng)的重要代謝酶之一［２２］。動(dòng)物中，，胰逡逑腺脂肪酶在脂肪代謝中具有重要作用（圖２）。植物中脂肪酶則是在能量?jī)?chǔ)備組逡逑織中被發(fā)現(xiàn)的，而微生物來(lái)源的脂肪酶也含量豐富［２３］。同時(shí)，脂肪酶也是人們逡逑最早開(kāi)展相關(guān)研究的重要理論研究酶，早在１８３４年，人們就注意到了兔胰腺脂逡逑肪酶的存在。隨后近百年來(lái)，胃脂肪酶（１９５４年）和植物種子脂肪酶（１８７１年）逡逑也陸續(xù)被報(bào)道，我國(guó)于１９６９年成功研制了脂假絲酵母脂肪酶制劑。其中微生物逡逑脂肪酶的研究從２０世紀(jì)初至今更是因其巨大的商業(yè)潛能而備受關(guān)注。如圖３所逡逑示，脂肪酶的研究熱度經(jīng)久不衰，相關(guān)研究仍具有非常深遠(yuǎn)的生理生化以及生逡逑產(chǎn)應(yīng)用意義［２４］。逡逑８逡逑

肪酶的存在。隨后近百年來(lái)，胃脂肪酶（１９５４年）和植物種子脂肪酶（１８７１年）逡逑也陸續(xù)被報(bào)道，我國(guó)于１９６９年成功研制了脂假絲酵母脂肪酶制劑。其中微生物逡逑脂肪酶的研究從２０世紀(jì)初至今更是因其巨大的商業(yè)潛能而備受關(guān)注。如圖３所逡逑示，脂肪酶的研究熱度經(jīng)久不衰，相關(guān)研究仍具有非常深遠(yuǎn)的生理生化以及生逡逑產(chǎn)應(yīng)用意義［２４］。逡逑８逡逑
【學(xué)位授予單位】：廈門(mén)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R91

【參考文獻(xiàn)】

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2 王霞;黃卓烈;;乙腈對(duì)α-淀粉酶催化活性的影響[J];科技信息(科學(xué)教研);2008年16期

3 趙妍;曹q

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