【摘要】：肝細(xì)胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是一種對人類危害極大的惡性腫瘤。2018年最新的全球腫瘤統(tǒng)計分析結(jié)果顯示,肝癌的發(fā)病率占全球癌癥發(fā)病總數(shù)的4.7%,致死率占8.2%。中國是全球肝癌高發(fā)國家,每年新發(fā)病例數(shù)占全球新發(fā)病例數(shù)的50%以上。肝癌早期通常無明顯癥狀,中晚期肝癌的癥狀則較多,如消瘦、乏力、肝區(qū)疼痛、消化道癥狀等。很多患者就診時已屬中晚期,錯過手術(shù)治療的最佳時期。索拉非尼作為可口服的小分子激酶抑制劑,是首個獲批用于治療晚期肝細(xì)胞癌的分子靶向藥物,其在臨床治療中發(fā)揮了顯著的療效。但索拉非尼治療晚期肝癌的效果依然有限,且隨著耐藥性和一些不良反應(yīng)的發(fā)生,影響了其療效的發(fā)揮。為提高治療效果、減少不良反應(yīng),近年來有關(guān)索拉非尼聯(lián)合用藥治療肝癌的研究越來越多。青蒿琥酯為青蒿素的衍生物,現(xiàn)為臨床安全有效的抗瘧藥,近年來研究發(fā)現(xiàn)其在體內(nèi)外對腫瘤均有抑制作用,且能與其他化療藥物聯(lián)用產(chǎn)生協(xié)同抗腫瘤作用。本課題研究青蒿琥酯和索拉非尼組合使用在體內(nèi)外對肝癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響,探討其聯(lián)合應(yīng)用潛在的機(jī)制,為索拉非尼在臨床上聯(lián)合治療提供新思路。研究目的:研究索拉非尼和青蒿琥酯組合使用對肝癌細(xì)胞增殖和凋亡的作用,并探討其潛在機(jī)制。研究方法:采用MTT方法,分別評價索拉非尼、青蒿琥酯兩者單用及聯(lián)合使用對肝癌細(xì)胞增殖的影響;采用周-特氏聯(lián)合指數(shù)法(Chou-Talalay combination index analysis)評價索拉非尼和青蒿琥酯聯(lián)合使用對肝癌細(xì)胞增殖抑制的協(xié)同作用;采用Hoechst/PI染色及Caspase3/7試劑盒,評價索拉非尼、青蒿琥酯單用及聯(lián)合使用對肝癌細(xì)胞凋亡的影響;應(yīng)用二氯熒光素(Dichlorofluorescein,DCF)法檢測青蒿琥酯對肝癌細(xì)胞活性氧產(chǎn)生的影響;應(yīng)用Western blot方法檢測索拉非尼、青蒿琥酯單用及聯(lián)合使用對凋亡蛋白及細(xì)胞信號通路的影響;應(yīng)用荷瘤裸鼠評價索拉非尼和青蒿琥酯聯(lián)合使用對肝癌細(xì)胞體內(nèi)增殖的影響。研究結(jié)果:青蒿琥酯單獨(dú)使用可劑量依賴性地抑制肝癌細(xì)胞HepG2、PLC/PRF/5、HCCLM3、Hep3B和HuH7的增殖,IC_(50)分別是37.4μmol/L、121.2μmol/L、44.2μmol/L、41.6μmol/L、46.4μmol/L。索拉非尼單獨(dú)使用也能劑量依賴性地抑制肝細(xì)胞癌HepG2、PLC/PRF/5、HCCLM3、Hep3B和HuH7的增殖,IC_(50)分別是6.1μmol/L、7.4μmol/L、14.7μmol/L、3.6μmol/L、2.6μmol/L。青蒿琥酯對肝癌細(xì)胞增殖的抑制活性較索拉非尼弱。Hoechst/PI染色結(jié)果顯示,10μmol/L索拉非尼與不同濃度(10、30、100μmol/L)的青蒿琥酯聯(lián)用與索拉非尼單藥組相比,HuH7細(xì)胞凋亡率增加了18.4%、44.6%、69.5%;HepG2細(xì)胞凋亡率增加了2%、14%、48.1%;PLC/PRF/5細(xì)胞凋亡率增加了5.9%、22.9%、51.7%。在Caspase3/7激活實(shí)驗(yàn)中,索拉非尼和青蒿琥酯聯(lián)合使用明顯增加了HuH7、HepG2和PLC/PRF/5細(xì)胞Caspase3/7活化水平。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,聯(lián)合用藥組HuH7細(xì)胞線粒體Bax/Bcl-2水平顯著高于單獨(dú)用藥組。DCF法檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧結(jié)果顯示,青蒿琥酯可增加HuH7和Hep3B細(xì)胞內(nèi)活性氧的水平。加入抗氧化劑N-乙酰-L-半胱氨酸(N-Acetyl-L-cysteine,NAC)可劑量依賴性地減弱青蒿琥酯對HuH7和Hep3B細(xì)胞增殖的抑制作用,提示我們青蒿琥酯通過產(chǎn)生活性氧發(fā)揮抗腫瘤作用。我們探討了聯(lián)合使用索拉非尼和青蒿琥酯產(chǎn)生協(xié)同抗腫瘤作用的機(jī)制。索拉非尼是蛋白激酶抑制劑,通過抑制Raf/MEK/ERK和JAK2/STAT3信號傳導(dǎo)通路抑制腫瘤生長。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明索拉非尼單用可降低p-ERK和p-STAT3的水平,青蒿琥酯單用卻增加了p-ERK和p-STAT3的表達(dá)水平,兩者聯(lián)合使用時索拉非尼能夠有效逆轉(zhuǎn)青蒿琥酯誘導(dǎo)的p-ERK和p-STAT3水平升高。我們推測,青蒿琥酯通過促進(jìn)細(xì)胞產(chǎn)生活性氧發(fā)揮抗腫瘤作用,但其對p-ERK和p-STAT3的激活作用在一定程度上促進(jìn)了細(xì)胞的存活,聯(lián)合使用時,索拉非尼抵消了其對p-ERK和p-STAT3的激活作用,從而產(chǎn)生協(xié)同抗腫瘤作用。為了驗(yàn)證該假設(shè),我們采用ERK信號通路特異性抑制劑PD0325901或STAT3通路特異性抑制劑Stattic,發(fā)現(xiàn)其與青蒿琥酯聯(lián)合使用均具有明顯的協(xié)同作用。為了進(jìn)一步驗(yàn)證索拉非尼和青蒿琥酯聯(lián)合使用的抗腫瘤活性,我們采用裸鼠移植瘤模型來觀察其在體內(nèi)對腫瘤的生長抑制情況。裸鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與正常對照組相比,青蒿琥酯組有抑制腫瘤生長的趨勢,索拉非尼組能明顯抑制腫瘤生長。但聯(lián)合用藥組與索拉非尼單用組相比無統(tǒng)計學(xué)差異。我們推測可能與青蒿琥酯自身抗腫瘤活性弱及半衰期短有關(guān)。本研究結(jié)果表明索拉非尼能夠逆轉(zhuǎn)青蒿琥酯對ERK和STAT3信號通路的激活作用,二者組合使用在體外具有協(xié)同抗肝癌的作用。課題組正在對青蒿琥酯的結(jié)構(gòu)改造開展研究,旨在發(fā)現(xiàn)活性更強(qiáng)并具有良好藥代動力學(xué)特點(diǎn)的新型青蒿素類抗肝癌藥物,未來能夠單獨(dú)或與索拉非尼組合給肝癌的治療帶來潛在益處。研究結(jié)論:1.索拉非尼能夠劑量依賴性地抑制肝癌細(xì)胞增殖。2.青蒿琥酯能夠劑量依賴性地抑制肝癌細(xì)胞增殖,但活性較索拉非尼弱。3.索拉非尼和青蒿琥酯組合使用在體外能夠協(xié)同抑制肝癌細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。4.索拉非尼與青蒿琥酯協(xié)同抗腫瘤機(jī)制可能與索拉非尼抑制青蒿琥酯對ERK和STAT3信號通路的激活有關(guān)。5.青蒿琥酯體外抗肝癌活性弱,而且半衰期短,這些不利因素可能影響其體內(nèi)抗腫瘤活性。6.對青蒿琥酯進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾,發(fā)現(xiàn)活性強(qiáng)并具有良好藥代動力學(xué)特點(diǎn)的新型青蒿素類衍生物,單獨(dú)或與索拉非尼組合使用將為肝癌的治療帶來潛在的益處。
【學(xué)位授予單位】：青島大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R96

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本文編號：2645320