【摘要】：醫(yī)藥用途的多肽因其具有特異性好、免疫原性低的優(yōu)勢,在藥物研發(fā)中愈發(fā)受重視。近些年隨著藥用多肽以及疾病監(jiān)測相關多肽試劑研究的發(fā)展,解決了人類一系列疾病的發(fā)現(xiàn)和治療等問題。藥用多肽,尤其是富含二硫鍵類小蛋白,研究其二硫鍵折疊或變構帶來的功能影響對其自身藥物改性至關重要。所以針對富含二硫鍵類藥用多肽,發(fā)展新方法研究其二硫鍵功能并改性具有重要意義及應用價值。而檢測用途的多肽試劑的發(fā)展則為疾病的檢測和藥物的篩選提供了有力的工具。圍繞醫(yī)藥用途的多肽研究,本論文主要內(nèi)容和結(jié)論分為以下兩個部分:鐵調(diào)素(Hep)是含有四對二硫鍵的信號肽,與受體鐵轉(zhuǎn)運蛋白(FPN)結(jié)合后使FPN內(nèi)吞并降解。抑制FPN將胞內(nèi)鐵離子過度轉(zhuǎn)運至血液的功能,可以避免引發(fā)血色沉著病、阿爾茨海默癥等癥狀的發(fā)生。臨床上將Hep作為相關疾病的治療藥物已取得了部分成功。但是目前對Hep和FPN的結(jié)合模式是否依賴Hep中二硫鍵變構的問題存在爭議,這阻礙了Hep的進一步改性、優(yōu)化。我們首次提出了用非還原性硫醚鍵替代的策略來檢測富二硫鍵小蛋白與其受體之間二硫鍵交換的問題。該策略具有對蛋白結(jié)構擾動較小,還原條件下穩(wěn)定的優(yōu)勢。將二氨基二酸合成子通過SPPS技術分別嵌入到Hep蛋白中四對二硫鍵的位置,形成含有硫醚鍵替代的Hep衍生物。我們用Hep衍生物來驗證Hep與FPN的結(jié)合模式,得到了更加明確的結(jié)論:Hep與FPN之間,特別是Hep Cys7與FPN Cys326之間,不存在經(jīng)典的二硫鍵結(jié)合模式。這為藥用Hep的改性提供了新思路:Cys7不是Hep產(chǎn)生活性的決定性因素。經(jīng)改性我們最終獲取了高活性的Mini-Hep。泛素化作為近些年發(fā)現(xiàn)的新型蛋白質(zhì)翻譯后修飾,在生理健康調(diào)節(jié)中起到關鍵作用。在泛素化通路中,去泛素化酶作為一類泛素化修飾的負調(diào)控蛋白,它的功能紊亂現(xiàn)象與癌癥的發(fā)生息息相關。目前以去泛素化酶作為抑制靶點的小分子抑制劑藥物的研發(fā)愈發(fā)受重視。前人篩選策略中,Ub-PA作為一種新型的活性探針,相較于Ub-AMC,不存在因小分子抑制劑的吸收或激發(fā)波段與AMC熒光分子重合而帶來的假陽性結(jié)果的缺陷,因而成為用于去泛素化酶篩選的首選試劑。但Ub-PA存在化學合成過程繁瑣產(chǎn)率低的問題。為了更好滿足篩選過程中對工具的需求,我們發(fā)展了新的半合成策略:利用生物表達大量獲取合成所需模塊并結(jié)合化學方法制備關鍵中間產(chǎn)物泛素酰肼,然后再通過�；瘜W反應組裝炔烴分子。利用該策略我們可以在短期內(nèi)快速獲取上百毫克級活性探針。并使用該探針完成了對USP14去泛素化酶抑制劑IU1的篩選,展示運用新合成策略獲取的探針工具具有良好的生物活性。
【圖文】：

圖 1.7 縮合劑活化氨基酸羧酸官能團Fig 1.7 Mechanism of the production of racemates during peptide synthesis前常用的活化劑種類按活化官能團以及活化機制可分為銨鹽型、活化脂類二亞胺型等（如圖 1.8）。 1978 年，Gross 等人將 O-(IH-苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基異脲六氟（HBTU）用于活化氨基酸羧酸端，來輔助多肽的合成。開始人們廣泛認與氨基酸之間是通過雜環(huán)上氧-氨基酸羰基之間形活化硫脂。但后來經(jīng)過學的輔助研究，現(xiàn)階段普遍認為 HBTU 的活化機制是通過胍基官能團起酸的作用。在此基礎上，后人又開發(fā)出了多種銨鹽類型的活化劑。O-(7-三唑-1-基)-N,N,N′,N′-四甲基脲（HATU），O-(6-氯苯并三唑-1-基)-N,N,N',脲六氟磷酸酯（HCTU）。在實際多肽合成過程中，O-(7-氮雜苯并三唑-,N′,N′-四甲基脲的活性要大于 O-(6-氯苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲酸酯，大于 O-(IH-苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基異脲六氟化磷。HATT 組合使用，在提高偶聯(lián)效率的同時，還可以消除對映體的副產(chǎn)物。除

圖 1.18 基于絲氨酸/蘇氨酸位點的連接策略Fig 1.18 Linking strategy based on serine/threonine sites方法成策略在大量獲取合成所需多肽蛋白質(zhì)片段方面，，相對于化學全無可比擬的優(yōu)勢。半合成所需的目標蛋白可以用生物體直接表達方法完成復雜蛋白質(zhì)的體外獲取。成策略在泛素相關領域的相關應用，主要包含 Intein 法、sortase 酶ne 的轉(zhuǎn)硫酯法以及 YUH1 酶解法等。n 法大蛋白來說（大于 300 個氨基酸殘基），較為經(jīng)濟的合成途徑是與自然生物表達片段通過自然化學連接反應進行偶聯(lián)，在體外獲具體步驟是：將內(nèi)含肽的碳末端天冬酰胺突變?yōu)楸彼�，接著�?
【學位授予單位】：合肥工業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R914

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