【摘要】：目的:Ⅰ型糖尿病是一種以β細(xì)胞永久性破壞為特征的糖尿病類型,病人需要終生注射胰島素,然而注射胰島素存在很多不足之處:缺乏肝臟特異性,容易引起低血糖癥;病人需要頻繁的注射,增加了病人的痛苦。轉(zhuǎn)鐵蛋白融合蛋白技術(shù)被廣泛的應(yīng)用于蛋白質(zhì)藥物的生產(chǎn),例如,胰島素原轉(zhuǎn)鐵蛋白融合蛋白(ProINS-Tf)已被研究者通過HEK293細(xì)胞成功表達(dá),經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明其同時(shí)具備肝臟特異性和長時(shí)降血糖的作用。為了提高產(chǎn)量,本研究嘗試?yán)么竽c桿菌誘導(dǎo)表達(dá)ProINS-Tf并檢測其活性。在此基礎(chǔ)上為了進(jìn)一步提高產(chǎn)量,我們通過分子生物學(xué)手段去除轉(zhuǎn)鐵蛋白的C端序列,進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)及純化,比較兩種重組蛋白的產(chǎn)量及活性,從而為一種新型的胰島素類似物的工業(yè)化生產(chǎn)奠定一些基礎(chǔ)。方法:設(shè)計(jì)并合成重組質(zhì)粒pET28a/Pro INS-Tf,在此基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR獲得Pro INS-NTf的序列,通過酶切連接入pET28a表達(dá)載體獲得重組質(zhì)粒pET28a/ProINS-NTf以表達(dá)ProINS-NTf,將兩種質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入BL21(DE3),利用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白,經(jīng)鎳柱親和層析純化獲得高純度的重組蛋白。通過向鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)的I型糖尿病小鼠注射純化后的兩種重組蛋白以檢測其活性。結(jié)果:兩種重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入BL21(DE3)后分別誘導(dǎo)表達(dá)出分子量為90kDa和50kDa的目的蛋白,均以包涵體形式表達(dá)。經(jīng)過變性和復(fù)性后,ProINS-Tf和ProINS-NTf重組蛋白轉(zhuǎn)變成了可溶形式,經(jīng)鎳柱親和層析純化后得到了較高純度的重組蛋白。向STZ誘導(dǎo)的I型糖尿病小鼠皮下注射純化后的ProINS-Tf(67.5nmol/kg)和Pro INS-NTf(67.5 nmol/kg),注射Pro INS-Tf(67.5 nmol/kg)組的小鼠血糖緩慢下降并長時(shí)間的維持在低水平,注射ProINS-NTf(67.5 nmol/kg)組的小鼠血糖下降不明顯。結(jié)論:1:pET28a-Pro INS-Tf/BL21能夠高效表達(dá)Pro INS-Tf,經(jīng)過變性,復(fù)性和純化后得到了高純度且有生物學(xué)活性的目的蛋白;2:ProINS-NTf不具有和ProINS-Tf一樣的降血糖活性。
【圖文】：

圖 1-1 pET28a-ProINS-Tf 表達(dá)載體圖譜Fig.1-1 The map of pET28a-ProINS-Tf plasmidProINS-Tf 重組蛋白的表達(dá)合成的 pET-ProINS-Tf 重組質(zhì)粒 10 ng 轉(zhuǎn)化入 50 μL 大腸桿

圖 1-4 不同濃度的尿素溶解 ProINS-Tf 包涵體: 蛋白 marker；1-7：3-9M 尿素溶解 ProINS-Tf 包涵體；8:ProINS-Tf 包涵g. 1-4 ProINS-Tf inclusion bodies dissolved with different concentrations of M: protein molecular weight standard; lane 1-7: 3-9M urea dissolved ProINS-inclusion body lane8: ProINS-Tf inclusion body
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R914

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本文編號(hào)：2642164