【摘要】：研究背景十氯酮(CLD)又名開蓬,是一種人工合成的有機(jī)氯農(nóng)藥,由于其存在多種毒性效應(yīng),現(xiàn)已被國際社會(huì)禁止生產(chǎn)和使用。作為自然界中常見的持久性有機(jī)污染物(POPs)之一,十氯酮對環(huán)境和人類健康都造成了深遠(yuǎn)的影響。近年來調(diào)查發(fā)現(xiàn)我國十氯酮污染情況逐年加重,但國內(nèi)尚未系統(tǒng)的開展其毒性作用的研究,因此對十氯酮毒效應(yīng)的研究刻不容緩。研究目的本研究以秀麗隱桿線蟲為模型,分別從個(gè)體、組織、細(xì)胞和分子水平探討十氯酮對線蟲雄性生殖系統(tǒng)的毒作用效應(yīng)及其誘發(fā)生殖毒性的作用機(jī)制。研究方法在觀察個(gè)體水平野生型線蟲后代數(shù)目、世代時(shí)間和雄蟲雜交后代數(shù)目等指標(biāo),評價(jià)十氯酮對線蟲生育力影響的基礎(chǔ)上,通過體視顯微鏡觀察性腺面積、熒光顯微鏡下觀察JK2868突變體性腺遠(yuǎn)端頂細(xì)胞(DTC)發(fā)育,DAPI熒光染色測定有絲分裂區(qū)、減數(shù)分裂區(qū)生殖細(xì)胞及精細(xì)胞數(shù)目,微分干涉差顯微鏡(DIC)下測定精子畸形率,精子活化率等指標(biāo)探究十氯酮產(chǎn)生雄性生殖毒性作用的靶器官及對精細(xì)胞發(fā)育過程中的作用靶點(diǎn)。在分子水平上通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)測定十氯酮暴露后調(diào)控精子活化關(guān)鍵步驟精子主要蛋白(MSP)聚合過程的CEP-8通路基因及調(diào)控DNA損傷誘導(dǎo)生殖細(xì)胞周期停滯相關(guān)基因表達(dá)水平變化情況。通過CM-H2DCFDA探針檢測線蟲體內(nèi)活性氧自由基(ROS)水平,抗氧化酶試劑盒檢測過氧化氫酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)的活性判斷十氯酮對線蟲氧化應(yīng)激的影響,RT-q PCR技術(shù)測定相關(guān)基因gas-1,mev-1,isp-1,sod-1,sod-2,ctl-1的表達(dá)水平,并利用自由基清除劑甘露醇探討對十氯酮造成的生殖毒性保護(hù)作用。研究結(jié)果十氯酮暴露后,在個(gè)體水平上野生型線蟲各劑量組后代數(shù)目降低,世代時(shí)間中高劑量組有所延長;雜交實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與空白對照組相比,各暴露組后代數(shù)目均有所減少。組織和細(xì)胞水平上發(fā)現(xiàn)十氯酮暴露造成線蟲性腺面積減少,低劑量組面積與對照組相比約減少20%,中高劑量組與空白對照組比較面積減少了約40%;各暴露組的DTC細(xì)胞熒光強(qiáng)度與空白對照組比較也有所降低;有絲分裂區(qū)生殖細(xì)胞數(shù)、減數(shù)分裂區(qū)生殖細(xì)胞數(shù)和精細(xì)胞數(shù)均減少并且下降趨勢與后代數(shù)目相同;精子畸形率升高,活化率下降。分子水平上在對十氯酮生殖毒作用機(jī)制研究中發(fā)現(xiàn)調(diào)控MSP相關(guān)基因spe-8,spe-12,spe-19和spe-29表達(dá)水平下調(diào),spe-6表達(dá)上調(diào),spe-27與對照組相比無明顯變化。DNA損傷試驗(yàn)中暴露組熒光點(diǎn)狀聚合表達(dá)細(xì)胞數(shù)量上升,且相關(guān)基因cep-1、hus-1和clk-2基因表達(dá)上調(diào)。在進(jìn)一步對線蟲氧化應(yīng)激情況研究中發(fā)現(xiàn)十氯酮暴露后,中高劑量組ROS水平升高;SOD活性在低濃度組中略有上升,在中高濃度組中下降;CAT含量降低;氧化應(yīng)激相關(guān)基因gas-1與mev-1基因在低濃度下表達(dá)無差異,中高濃度組下調(diào);isp-1表達(dá)上調(diào);sod-1和sod-2基因在低濃度下表達(dá)量略有上升,在高濃度組中下降;ctl-1基因表達(dá)下調(diào)。自由基清除劑甘露醇處理后發(fā)現(xiàn)5m M和20m M濃度的甘露醇有效降低了十氯酮暴露后線蟲體內(nèi)的ROS水平,且20m M的甘露醇將線蟲體內(nèi)ROS水平恢復(fù)至與空白對照組同一水平。當(dāng)十氯酮與甘露醇聯(lián)合暴露后,有絲分裂區(qū)生殖細(xì)胞數(shù)有所恢復(fù),但與空白對照組相比仍有差異。結(jié)論十氯酮可通過調(diào)控線蟲氧化應(yīng)激相關(guān)基因,引起線蟲體內(nèi)氧化損傷,對性腺結(jié)構(gòu)發(fā)育產(chǎn)生影響,同時(shí)激活CEP-1通路造成生殖細(xì)胞DNA損傷,導(dǎo)致生殖細(xì)胞周期停滯,精細(xì)胞數(shù)目減少,可影響精子發(fā)生;自由基清除劑甘露醇可在一定程度上緩解十氯酮的生殖毒作用。十氯酮可抑制SPE-8通路,引起MSP聚合異常,干擾精子正�；罨�,形成畸形、無運(yùn)動(dòng)能力精子,造成精子數(shù)量減少,形態(tài)異常,導(dǎo)致雄性生殖功能障礙。
【圖文】：

酮與滅蟻靈分子結(jié)構(gòu)見圖 1），已有研究表明在使用過滅蟻靈的地區(qū)檢測到十酮存在[17]。滅蟻靈的使用是造成我國環(huán)境中十氯酮污染的主要原因。一般工生產(chǎn)的滅蟻靈中十氯酮濃度為 2.58 mg/kg。相較于滅蟻靈，十氯酮性質(zhì)更不易變，到目前為止自然環(huán)境中未有其次級產(chǎn)物被檢測到[18]。我國雖然未有十氯的生產(chǎn)和使用記錄，但直到十氯酮被列入全球禁用名單為止，在我國東部地區(qū)有大量滅蟻靈被使用[19]。最新監(jiān)測顯示，我國東部沿海地區(qū)十氯酮檢出率較，錦州灣的 15 個(gè)檢測位點(diǎn)全部檢測有十氯酮?dú)埩�，殘留范圍�?0.34～.69ug/kg，平均殘留量為 2.43ug/kg，某些高濃度地區(qū)已接近甚至超過國際限定 10ug/kg[20]。因?yàn)槲覈⒉皇鞘韧闹苯由a(chǎn)與使用國，所以國內(nèi)對十氯酮染情況及毒性作用研究較少。但隨著滅蟻靈的降解作用，近年來調(diào)查發(fā)現(xiàn)我國氯酮污染狀況愈發(fā)嚴(yán)重，對其毒效應(yīng)研究迫在眉睫。因此，為了更好履行我國為斯德哥爾摩公約締結(jié)國的責(zé)任，更好的保護(hù)環(huán)境和人群健康，，我國應(yīng)積極開十氯酮污染情況調(diào)查，探究十氯酮對人體造成毒性作用的機(jī)制。

線蟲生殖細(xì)胞位置相對固定，有利于研究生殖細(xì)胞發(fā)生過程，并多種生殖功能潛在靶點(diǎn)。同時(shí)線蟲有雌雄同體、雄性、雌性三種性別，相乳動(dòng)物在進(jìn)行交配實(shí)驗(yàn)，研究精子發(fā)生、交配行為、生育力等毒作用方面優(yōu)勢。此外，線蟲的全基因組測序已經(jīng)完成，線蟲生殖系統(tǒng)的功能與機(jī)制相當(dāng)豐富，有利于進(jìn)行相應(yīng)的作用機(jī)制研究。線蟲體內(nèi)約 40%的蛋白編碼人類同源[37]，因此線蟲毒作用分子機(jī)制的研究對哺乳動(dòng)物及人的毒理學(xué)子通路和特異性應(yīng)答基因方面具有提示作用[38]。同時(shí)線蟲中對精子發(fā)生及交配行為評價(jià)的指標(biāo)也較為豐富。線蟲通體透明，可以應(yīng)用熒光顯微技觀察線蟲的生殖系統(tǒng)發(fā)育情況和生殖細(xì)胞的發(fā)生過程。加之線蟲培養(yǎng)周期所需設(shè)備低廉、成本低、適于大規(guī)模推廣，并且對實(shí)驗(yàn)室人員無害等優(yōu)勢 3R 原則。因此，利用秀麗線蟲研究十氯酮對雄性生殖系統(tǒng)的毒理學(xué)作用毒理學(xué)評價(jià)早期的初步篩選，以及在特定機(jī)制研究等方面具有較大優(yōu)勢，強(qiáng)的可行性。
【學(xué)位授予單位】：東南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R994.3

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 王艷潔;那廣水;王震;徐恒振;姚子偉;;檢出限的涵義和計(jì)算方法[J];化學(xué)分析計(jì)量;2012年05期

2 孫翠香;高原雪;劉婷琳;黃德銀;畢鴻亮;;土壤中十氯酮檢測方法研究[J];生態(tài)環(huán)境學(xué)報(bào);2011年04期

3 毛培新;孫雷;陳寶喜;顏鴻飛;俞凌云;;紡織品中碳氯靈、異艾氏劑、乙滴涕和十氯酮的測定方法[J];中國測試;2013年S2期

4 邱美輝;;POPs替代物研發(fā)日趨緊迫 全球再禁9種有毒化學(xué)品[J];農(nóng)藥市場信息;2009年13期

5 孫武勇;徐銘蔓;郭會(huì)清;魏東偉;禹建鷹;張守杰;;氣相色譜-質(zhì)譜法快速測定棉花中新型含氯農(nóng)藥[J];中國棉花;2016年04期

6 ;環(huán)境醫(yī)學(xué)[J];環(huán)境科學(xué)文摘;2010年05期

7 周麗;黃業(yè)茹;楊盛;董亮;史雙昕;張利飛;張秀藍(lán);楊文龍;李玲玲;;環(huán)境中十氯酮的研究進(jìn)展[J];環(huán)境化學(xué);2013年05期

8 周麗;董亮;史雙昕;張利飛;張秀藍(lán);楊文龍;李玲玲;黃業(yè)茹;;液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定水環(huán)境中的十氯酮[J];色譜;2014年03期

9 洪華;申曉萍;李培才;王紅衛(wèi);劉沙;張冰;侯晉;;染整處理對棉紡織品農(nóng)藥殘留量影響的研究[J];化學(xué)分析計(jì)量;2014年01期

10 王薈;彭英;穆肅;章勇;;氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定土壤中十氯酮[J];中國環(huán)境監(jiān)測;2015年05期

相關(guān)會(huì)議論文 前1條

1 張穎;戴抒豪;浦躍樸;尹立紅;;十氯酮對秀麗隱桿線蟲精子形成的影響[A];中國毒理學(xué)會(huì)第七次全國會(huì)員代表大會(huì)暨中國毒理學(xué)會(huì)第六次中青年學(xué)者科技論壇論文摘要[C];2018年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前3條

1 記者 王秀蘭;又有4種化學(xué)品被提名列入受控名單[N];中國化工報(bào);2005年

2 邱美輝;POPs替代物研發(fā)日趨緊迫[N];中國化工報(bào);2009年

3 本報(bào)記者 黃婷婷;早謀對策 積極應(yīng)對[N];中國環(huán)境報(bào);2012年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前2條

1 戴抒豪;十氯酮對秀麗隱桿線蟲的雄性生殖毒性作用及機(jī)制[D];東南大學(xué);2018年

2 翟培源;環(huán)境雌激素十氯酮對雌性棕色田鼠性傾向以及腦內(nèi)雌激素alpha受體分布影響的研究[D];陜西師范大學(xué);2009年

本文編號：2641501