【摘要】：目的:創(chuàng)新制備一種具有腫瘤靶向、攜帶siRNA、同時(shí)產(chǎn)生光熱效應(yīng)三重功效的新型金納米棒(Gold nanorod,GNR)納米靶向系統(tǒng)FA-GNA-siRNA。探究該系統(tǒng)介導(dǎo)的RNAi技術(shù)靶向沉默小鼠黑色素瘤細(xì)胞(B16-BL6)中BRAF基因以及對(duì)腫瘤細(xì)胞生物學(xué)功能的影響,研究聯(lián)合光熱治療法(Photothermal therapy,PTT)對(duì)小鼠黑色素瘤細(xì)胞凋亡的影響,以及探討FA-GNA-siRNA介導(dǎo)的RNAi技術(shù)聯(lián)合PTT對(duì)小鼠黑色素瘤的治療效果。方法:1.GNR-FA采用種子合成法制備金納米棒并進(jìn)一步功能化修飾。透射電子顯微鏡(TEM)、紫外-可見(jiàn)光譜、核磁共振氫譜觀察其大小和分散度、共振吸收峰、功能化修飾后的表面分子結(jié)構(gòu)。2.MTT法檢測(cè)修飾前后GNR對(duì)細(xì)胞的毒性。3.凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)觀察GNR-FA對(duì)siRNA裝載效果。4.細(xì)胞流式技術(shù)檢測(cè)FA-GNR-siRNA對(duì)B16-BL6細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率。5.qPCR及Western Blot觀察B16-BL6細(xì)胞/荷瘤小鼠BRAF基因/蛋白的沉默率及MEK-ERK信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)量。6.劃痕實(shí)驗(yàn)/Transwell遷移、MTT法、流式細(xì)胞術(shù)分別觀察BRAF沉默遷移、增殖能力的變化。7.溫度計(jì)監(jiān)控GNR的光熱效應(yīng);MTT法、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)GNR對(duì)細(xì)胞的光熱效應(yīng)、金納米棒介導(dǎo)的RNAi技術(shù)聯(lián)合PTT對(duì)B16-BL6細(xì)胞凋亡的影響。8.建立C57BL/6 B16-BL6荷瘤小鼠模型,采用透皮給藥進(jìn)行治療,觀察對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響。結(jié)果:1.GNR修飾后紫外吸收峰由發(fā)生明顯的紅移,透射電鏡顯示尺寸并未發(fā)生明顯的變化,核磁共振氫譜進(jìn)一步說(shuō)明FA連接GNR成功。2.MTT法顯示修飾后的FA-GNR毒性明顯下降。3.凝膠阻滯顯示GNR-FA與siRNA的質(zhì)量比為3.5:1時(shí)為最適裝載比例,可最大程度攜帶siRNA。4.流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示GNR-FA對(duì)siRNA的轉(zhuǎn)染效率明顯高于GNR-PEI,并隨濃度增加而增加,與熒光顯微鏡下觀察一致,其轉(zhuǎn)染效率受血清的影響較小。5.qPCR、Western blot結(jié)果顯示體外BRAF在基因和蛋白水平沉默率均達(dá)到了80%以上。6.基因沉默BRAF后,黑色素腫瘤細(xì)胞增殖能力及遷移能力均明顯下降,MEK-ERK信號(hào)通路P-MEK、P-ERK蛋白下調(diào)明顯。7.在光密度4w/cm~2,激光照射5min的PTT效果明顯,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)RNAi聯(lián)合PTT明顯促進(jìn)B16-BL6細(xì)胞的凋亡。8.體內(nèi)聯(lián)合治療組較其他對(duì)照組和治療組明顯抑制腫瘤生長(zhǎng)速度、減小腫瘤體積、減輕腫瘤重量。結(jié)論:1.GNR-FA能夠安全有效靶向?qū)雜iRNA并沉默B16-BL6細(xì)胞中的BRAF基因,改變其生物學(xué)特性,抑制腫瘤生長(zhǎng),促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡。2.GNR-FA介導(dǎo)的RNAi聯(lián)合PTT可有效抑制B16-BL6黑色素腫瘤細(xì)胞在荷瘤小鼠的生長(zhǎng)。
【圖文】：

18圖 1. 金納米棒合成、功能化、表征、載藥量及毒性A. GNR-FA 的 TEM 圖 B. GNR-CTAB、GNR-PEI、GNR-FA 的紫外吸收?qǐng)D C.GNR-CTAB修飾前后的核磁共振圖譜（a:GNR-PEI 的核磁共振圖譜；b: GNR-FA 的核磁共振圖譜)D.FA-GNR 對(duì) siRNA 的承載量 E. GNR-CTAB 、GNR-FA 對(duì) B16-BL6 細(xì)胞的 24hrs、48hrs毒性.3.2 siRNA 腫瘤靶向遞送和體外 BRAF 基因沉默接下來(lái)，我們通過(guò) FA-GNR-siBRAF 測(cè)試了 siRNA 的靶向遞送。據(jù)觀察，只有 FA 引導(dǎo)的 GNR 可以有效地將 siRNA 遞送至 B16-BL6 黑素瘤細(xì)胞，如在用FA-GNR-siRNA 孵育的細(xì)胞中觀察到明顯的 Cy3 標(biāo)記的 siRNA 的紅色熒光(圖2A)。然而，，這在用非 FA 引導(dǎo)的對(duì)照納米構(gòu)建體 PEI-GNR-siRNA 孵育的細(xì)胞中

圖 2. siRNA 腫瘤靶向遞送和體外 BRAF 基因沉默A.GNR-FA 修飾前后轉(zhuǎn)染的熒光照片（a,b 分別是 PEI-GNR-cy3-GAPDH 轉(zhuǎn)染 4h 的熒光照片；c,d 分別是 FA-GNR-cy3-GAPDH 轉(zhuǎn)染 4h 的白光和熒光照片 B. FA-GNRGAPDH 在 B16-BL6 細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率（流式細(xì)胞術(shù)**P=0.0018＜0.01，t 檢驗(yàn)）C別是qPCR、Western blot檢測(cè)體外沉默BRAF基因的效率（c是b的統(tǒng)計(jì)圖），*P=0.013***P=0.0006<0.001，t 檢驗(yàn)。3.3 siRNA 抗血清轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞由于血清是有效轉(zhuǎn)染 siRNA 的主要抑制劑，在血清存在下開(kāi)發(fā) siRN效遞送系統(tǒng)一直是一項(xiàng)挑戰(zhàn)。為了測(cè)試 FA-GNR-siRNA 是否具有血清抗在血清存在下體外轉(zhuǎn)染細(xì)胞的效果，我們使用 FA-GNR-siRNA 在含有不濃度的培養(yǎng)基中不同時(shí)間段轉(zhuǎn)染 B16-BL6 細(xì)胞，其基于納米顆粒上蛋白和解吸在大約最初的幾個(gè)小時(shí)達(dá)到平衡，并且約 6 小時(shí)后，細(xì)胞非靶向米顆粒數(shù)達(dá)到穩(wěn)定[24,25]。將 B16-BL6 與 100μg/ ml Cy3-標(biāo)記的 FA-GNR溫育 4hrs，8hrs，12hrs 和 24hrs，不同濃度的血清從 0 到 100％。結(jié)果顯示的轉(zhuǎn)染效率高于其他時(shí)間段，可能是由于葉酸受體介導(dǎo) B16-BL6 細(xì)
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R739.5;R943

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本文編號(hào)：2637796