【摘要】：目的:創(chuàng)新制備一種具有腫瘤靶向、攜帶siRNA、同時產生光熱效應三重功效的新型金納米棒(Gold nanorod,GNR)納米靶向系統(tǒng)FA-GNA-siRNA。探究該系統(tǒng)介導的RNAi技術靶向沉默小鼠黑色素瘤細胞(B16-BL6)中BRAF基因以及對腫瘤細胞生物學功能的影響,研究聯(lián)合光熱治療法(Photothermal therapy,PTT)對小鼠黑色素瘤細胞凋亡的影響,以及探討FA-GNA-siRNA介導的RNAi技術聯(lián)合PTT對小鼠黑色素瘤的治療效果。方法:1.GNR-FA采用種子合成法制備金納米棒并進一步功能化修飾。透射電子顯微鏡(TEM)、紫外-可見光譜、核磁共振氫譜觀察其大小和分散度、共振吸收峰、功能化修飾后的表面分子結構。2.MTT法檢測修飾前后GNR對細胞的毒性。3.凝膠阻滯實驗觀察GNR-FA對siRNA裝載效果。4.細胞流式技術檢測FA-GNR-siRNA對B16-BL6細胞的轉染效率。5.qPCR及Western Blot觀察B16-BL6細胞/荷瘤小鼠BRAF基因/蛋白的沉默率及MEK-ERK信號通路相關蛋白表達量。6.劃痕實驗/Transwell遷移、MTT法、流式細胞術分別觀察BRAF沉默遷移、增殖能力的變化。7.溫度計監(jiān)控GNR的光熱效應;MTT法、流式細胞術檢測GNR對細胞的光熱效應、金納米棒介導的RNAi技術聯(lián)合PTT對B16-BL6細胞凋亡的影響。8.建立C57BL/6 B16-BL6荷瘤小鼠模型,采用透皮給藥進行治療,觀察對腫瘤生長的影響。結果:1.GNR修飾后紫外吸收峰由發(fā)生明顯的紅移,透射電鏡顯示尺寸并未發(fā)生明顯的變化,核磁共振氫譜進一步說明FA連接GNR成功。2.MTT法顯示修飾后的FA-GNR毒性明顯下降。3.凝膠阻滯顯示GNR-FA與siRNA的質量比為3.5:1時為最適裝載比例,可最大程度攜帶siRNA。4.流式細胞術結果顯示GNR-FA對siRNA的轉染效率明顯高于GNR-PEI,并隨濃度增加而增加,與熒光顯微鏡下觀察一致,其轉染效率受血清的影響較小。5.qPCR、Western blot結果顯示體外BRAF在基因和蛋白水平沉默率均達到了80%以上。6.基因沉默BRAF后,黑色素腫瘤細胞增殖能力及遷移能力均明顯下降,MEK-ERK信號通路P-MEK、P-ERK蛋白下調明顯。7.在光密度4w/cm~2,激光照射5min的PTT效果明顯,流式細胞術檢測RNAi聯(lián)合PTT明顯促進B16-BL6細胞的凋亡。8.體內聯(lián)合治療組較其他對照組和治療組明顯抑制腫瘤生長速度、減小腫瘤體積、減輕腫瘤重量。結論:1.GNR-FA能夠安全有效靶向導入siRNA并沉默B16-BL6細胞中的BRAF基因,改變其生物學特性,抑制腫瘤生長,促進腫瘤細胞的凋亡。2.GNR-FA介導的RNAi聯(lián)合PTT可有效抑制B16-BL6黑色素腫瘤細胞在荷瘤小鼠的生長。
【圖文】：

18圖 1. 金納米棒合成、功能化、表征、載藥量及毒性A. GNR-FA 的 TEM 圖 B. GNR-CTAB、GNR-PEI、GNR-FA 的紫外吸收圖 C.GNR-CTAB修飾前后的核磁共振圖譜（a:GNR-PEI 的核磁共振圖譜；b: GNR-FA 的核磁共振圖譜)D.FA-GNR 對 siRNA 的承載量 E. GNR-CTAB 、GNR-FA 對 B16-BL6 細胞的 24hrs、48hrs毒性.3.2 siRNA 腫瘤靶向遞送和體外 BRAF 基因沉默接下來，我們通過 FA-GNR-siBRAF 測試了 siRNA 的靶向遞送。據觀察，只有 FA 引導的 GNR 可以有效地將 siRNA 遞送至 B16-BL6 黑素瘤細胞，如在用FA-GNR-siRNA 孵育的細胞中觀察到明顯的 Cy3 標記的 siRNA 的紅色熒光(圖2A)。然而，，這在用非 FA 引導的對照納米構建體 PEI-GNR-siRNA 孵育的細胞中

圖 2. siRNA 腫瘤靶向遞送和體外 BRAF 基因沉默A.GNR-FA 修飾前后轉染的熒光照片（a,b 分別是 PEI-GNR-cy3-GAPDH 轉染 4h 的熒光照片；c,d 分別是 FA-GNR-cy3-GAPDH 轉染 4h 的白光和熒光照片 B. FA-GNRGAPDH 在 B16-BL6 細胞中的轉染效率（流式細胞術**P=0.0018＜0.01，t 檢驗）C別是qPCR、Western blot檢測體外沉默BRAF基因的效率（c是b的統(tǒng)計圖），*P=0.013***P=0.0006<0.001，t 檢驗。3.3 siRNA 抗血清轉染腫瘤細胞由于血清是有效轉染 siRNA 的主要抑制劑，在血清存在下開發(fā) siRN效遞送系統(tǒng)一直是一項挑戰(zhàn)。為了測試 FA-GNR-siRNA 是否具有血清抗在血清存在下體外轉染細胞的效果，我們使用 FA-GNR-siRNA 在含有不濃度的培養(yǎng)基中不同時間段轉染 B16-BL6 細胞，其基于納米顆粒上蛋白和解吸在大約最初的幾個小時達到平衡，并且約 6 小時后，細胞非靶向米顆粒數達到穩(wěn)定[24,25]。將 B16-BL6 與 100μg/ ml Cy3-標記的 FA-GNR溫育 4hrs，8hrs，12hrs 和 24hrs，不同濃度的血清從 0 到 100％。結果顯示的轉染效率高于其他時間段，可能是由于葉酸受體介導 B16-BL6 細
【學位授予單位】：南昌大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R739.5;R943

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本文編號：2637796