【摘要】：研究背景根據(jù)2018年最新的全球癌癥統(tǒng)計報告顯示,肺癌(lung cancer)仍然是全世界發(fā)病率與死亡率最高的腫瘤類型。而中國是全世界肺癌發(fā)病率與死亡率最高的國家之一。化療仍然是目前治療肺癌最重要的手段之一。順鉑(Cisplatin)是目前用于治療肺癌的一線化療藥物。然而,化療只能延緩疾病的進(jìn)展,緩解率只有40%-50%。影響化療效果的因素有很多,包括影響單個細(xì)胞攝取藥物,代謝藥物或者排出藥物的基因突變,基因擴(kuò)增或表觀遺傳改變。其中,化療藥物滲透不足是導(dǎo)致化療失敗的一個重要因素。腫瘤血管的異常,細(xì)胞外基質(zhì)成分的組成差異,細(xì)胞間粘連,高間質(zhì)液壓等因素都可以限制化療藥的滲透。其中,腫瘤血管是大多數(shù)化療藥物到達(dá)腫瘤部位的第一道屏障,在化療藥物的遞送中起重要的作用�；熕幊丝梢詺⑺滥[瘤細(xì)胞外,還能影響腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞,破壞血管。然而,化療藥對腫瘤血管的破壞反過來會減少后續(xù)化療藥物運(yùn)輸?shù)侥[瘤組織中并削弱殺死腫瘤細(xì)胞的效果,導(dǎo)致化療失敗。血管結(jié)構(gòu)的完整性保證了化療藥物的正常輸送。完整的血管結(jié)構(gòu)由內(nèi)皮細(xì)胞,內(nèi)皮細(xì)胞之間的連接,周細(xì)胞和基底膜構(gòu)成。傳統(tǒng)的影響血管的因素如血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF),Dll4(Delta-like ligand 4),血管生成素1(Ang1)等主要影響內(nèi)皮細(xì)胞的增殖,遷移和穩(wěn)定。另外,內(nèi)皮細(xì)胞的代謝對血管結(jié)構(gòu)與功能的調(diào)節(jié)發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。雖然對細(xì)胞代謝的研究已經(jīng)開展了一個多世紀(jì),但內(nèi)皮細(xì)胞代謝從最近幾年才受到越來越多的關(guān)注。內(nèi)皮細(xì)胞的代謝主要依賴于糖酵解,且糖酵解的水平會隨著疾病狀態(tài)的變化而改變。據(jù)報道,抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞中的糖酵解激活劑6-磷酸果糖激酶-2/2,6-二磷酸果糖磷酸酶3(6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-biphosphatase 3,PFKFB3)可以使血管屏障變的更緊密,進(jìn)而促進(jìn)藥物遞送,增強(qiáng)化療效果。然而,內(nèi)皮細(xì)胞代謝調(diào)節(jié)血管結(jié)構(gòu)和功能的機(jī)制研究的很不清楚。雖然化療藥可以通過抑制DNA復(fù)制或微管代謝所涉及的酶來直接清除分裂的內(nèi)皮細(xì)胞,但是大部分的血管損傷可能是由于化療誘導(dǎo)的炎癥所導(dǎo)致的。在環(huán)巴胺誘導(dǎo)的腫瘤排斥過程中,巨噬細(xì)胞被激活產(chǎn)生干擾素γ(Interferonγ,IFNγ),進(jìn)而抑制血管生成。IFNγ是一種多效性炎癥因子,長期以來一直被認(rèn)為是抗腫瘤免疫的重要效應(yīng)分子,可以通過多種機(jī)制抑制腫瘤生長。反過來,IFNγ還可以促進(jìn)具有免疫逃避表型的腫瘤細(xì)胞的生長。IFNγ影響腫瘤的一個重要機(jī)制是調(diào)節(jié)腫瘤血管。我們自己團(tuán)隊的研究表明,IFNγ在炎癥作用下對腦內(nèi)皮細(xì)胞的緊密連接有調(diào)節(jié)作用;IFNγ可以降低內(nèi)皮細(xì)胞中Dll4信號通路的表達(dá),降低血管周細(xì)胞上粘附蛋白N-cadherin的表達(dá),將周細(xì)胞從血管中剝離,增加血管內(nèi)皮細(xì)胞的通透性,進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。但是IFNγ能否影響內(nèi)皮細(xì)胞的代謝尚未見報道。在本文中,我們評估了中和IFNγ能否阻斷順鉑誘導(dǎo)的腫瘤血管損傷并改善化療藥物的遞送。研究目的本文主要探討了中和IFNγ能否阻斷順鉑誘導(dǎo)的腫瘤血管損傷并改善化療藥物的遞送。并且引入代謝機(jī)制,證實中和IFNγ是通過降低內(nèi)皮細(xì)胞糖酵解,限制乳酸的過量生成,阻斷順鉑誘導(dǎo)的腫瘤血管損傷,而促進(jìn)化療藥的遞送,提高化療效果。這為肺癌的臨床治療提供了一個新的思路和靶點。研究方法1)免疫熒光(Immunofluorescence,IF)方法檢測單獨(dú)注射順鉑或者順鉑與中和IFNγ聯(lián)用對小鼠LLC肺癌腫瘤血管的影響。2)熒光定量PCR(Quantitative-PCR,Q-PCR)和細(xì)胞因子微球檢測(Cytometric Bead Array,CBA)方法檢測順鉑對小鼠LLC肺癌腫瘤組織中與血管相關(guān)的炎癥性因子表達(dá)的影響。3)海馬能量代謝檢測IFNγ對內(nèi)皮細(xì)胞(sEND.1)糖酵解水平的影響。4)流式細(xì)胞儀檢測IFNγ對內(nèi)皮細(xì)胞(sEND.1)糖攝入的影響。5)Western Blot檢測IFNγ對信號通路蛋白及糖酵解相關(guān)蛋白的影響。6)用乳酸試劑盒檢測IFNγ對內(nèi)皮細(xì)胞(sEND.1)乳酸產(chǎn)生的影響。7)免疫熒光和western blot方法檢測乳酸對內(nèi)皮細(xì)胞(sEND.1)中血管內(nèi)皮鈣粘蛋白(VE-cadherin)重分布和溶酶體活性的影響。8)滲透性實驗檢測乳酸對內(nèi)皮細(xì)胞(sEND.1)滲透功能的影響。9)檢測不同處理組:對照組,單獨(dú)注射順鉑組,順鉑與中和IFNγ聯(lián)用組,順鉑和中和IFNγ和乳酸聯(lián)用組對腫瘤血管,化療藥遞送及化療效果的影響。研究結(jié)果在本研究中,我們發(fā)現(xiàn)順鉑在LLC小鼠肺癌模型中破壞了腫瘤血管,通過RT-PCR及CBA篩選發(fā)現(xiàn)首次注射順鉑第2天后IFNγ的水平升高。在該時間點中和IFNγ阻斷了順鉑誘導(dǎo)的腫瘤血管損傷。接下來的研究發(fā)現(xiàn),IFNγ通過激活A(yù)KT,升高內(nèi)皮細(xì)胞糖酵解,最終促進(jìn)乳酸的產(chǎn)生。乳酸促進(jìn)溶酶體途徑依賴的VE-cadherin的內(nèi)吞和增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)VE-cadherin的降解,從而破壞血管完整性。抑制乳酸的產(chǎn)生逆轉(zhuǎn)了IFNγ誘導(dǎo)的VE-cadherin重分布。乳酸廢除了中和IFNγ在體內(nèi)對腫瘤血管的促進(jìn)作用。最后,研究發(fā)現(xiàn),特定時間點中和IFNγ促進(jìn)了化療藥的遞送,增強(qiáng)了化療效果。乳酸破壞了中和IFNγ對化療藥遞送的促進(jìn)作用,降低了化療效果。因此,我們的研究結(jié)果表明,通過中和IFNγ限制乳酸的過量產(chǎn)生可以阻斷順鉑誘導(dǎo)的腫瘤血管損傷并改善藥物遞送。研究結(jié)論本研究發(fā)現(xiàn)順鉑通過誘導(dǎo)IFNγ破壞血管,特定時間點中和IFNγ阻斷了順鉑對腫瘤血管的破壞。IFNγ通過升高內(nèi)皮細(xì)胞糖酵解,促進(jìn)乳酸的產(chǎn)生。乳酸通過激活溶酶體途徑的VE-cadherin的內(nèi)吞,破壞血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能。通過中和IFNγ,限制乳酸的過量生成促進(jìn)化療藥的遞送,提高化療效果。
【圖文】：

圖 1.1 LLC 肺癌移植瘤模型的構(gòu)建流程圖6 到 8 周齡雌性 C57BL/6 小鼠，皮下給予 1×106LLC 細(xì)胞，12 天后待腫瘤體積均超過200mm3左右時，開始腹腔注射順鉑（Cpt，，1mg/kg），隔天 1 次，一共 4 次。每隔 1 天觀察并記錄下小鼠腫瘤體積的變化，第 22 天處死小鼠，收取腫瘤組織。

圖 1.2 肺癌小鼠模型中順鉑對腫瘤血管結(jié)構(gòu)的破壞A-C: 免疫熒光方法分析肺癌小鼠模型中注射順鉑對 CD31+腫瘤血管的密度（A），內(nèi)皮細(xì)胞粘附連接蛋白 VE-cadherin 的分布（VE-cadherin+粘附連接沿著 CD31+腫瘤血管長度的百分比）（B）和 NG2+周細(xì)胞的覆蓋（NG2+周細(xì)胞沿著 CD31+腫瘤血管長度的百分比）（C的影響。每組 6 只小鼠。標(biāo)尺：100μm。數(shù)據(jù)表示為均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（***P<0.001）。
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R943

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本文編號：2634143