【摘要】：目的:研究和比較衍生自大腸桿菌外膜蛋白A(outer membrane protein A,OmpA)信號肽的多肽P-KKK在體外對標(biāo)準(zhǔn)細(xì)菌株及臨床分離耐藥菌株的殺菌活性,為研發(fā)新型抗菌藥物提供重要信息。方法:(1)衍生肽的設(shè)計(jì):依據(jù)大腸桿菌OmpA信號肽(P-AQA)的一級結(jié)構(gòu)MKKTAIAIAVALAGFATVAQA(蛋氨酸-賴氨酸-賴氨酸-蘇氨酸-丙氨酸-異亮氨酸-丙氨酸-異亮氨酸-結(jié)氨酸-丙氨酸-亮氨酸-丙氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-丙氨酸-蘇氨酸-結(jié)氨酸-丙氨酸-谷氨酰胺-丙氨酸)以及功能特點(diǎn),以其一級結(jié)構(gòu)為模板,在不改變其前部基本結(jié)構(gòu)的前提下,僅將其C末端的5個(gè)氨基酸進(jìn)行替換,設(shè)計(jì)衍生肽(P-KKK):MKKTAIAIAVALAGFARRKKK(蛋氨酸-賴氨酸-賴氨酸-蘇氨酸-丙氨酸-異亮氨酸-丙氨酸-異亮氨酸-結(jié)氨酸-丙氨酸-亮氨酸-丙氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-丙氨酸-精氨酸-精氨酸-賴氨酸-賴氨酸-賴氨酸)。(2)試驗(yàn)第一部分:衍生肽P-KKK對標(biāo)準(zhǔn)菌株殺菌活性測定:運(yùn)用瓊脂鋪板計(jì)數(shù)法,將不同濃度的衍生肽P-KKK分別與幾種細(xì)菌標(biāo)準(zhǔn)株(3種G~+菌:金黃色葡萄球菌、屎腸球菌、枯草芽孢桿菌;3種G~-菌:大腸桿菌、肺炎克雷伯桿菌、綠膿桿菌)在孵育體系中混勻后,置于37℃恒溫水浴箱孵育2小時(shí),瓊脂鋪板后置于37℃恒溫培養(yǎng)18~24h。然后記錄每一瓊脂板上菌落形成數(shù)量(CFU),并計(jì)算衍生多肽P-KKK作用后的殺菌率。(3)試驗(yàn)第二部分:衍生肽P-KKK對耐藥菌株殺菌活性測定:運(yùn)用瓊脂鋪板計(jì)數(shù)法,將不同濃度的衍生肽P-KKK分別與幾種耐藥菌株:(2種G~+菌耐藥菌株:耐甲氧西林金黃色葡萄球菌MRSA、高水平慶大霉素耐藥(HLGR)屎腸球菌;2種G~—菌耐藥菌株:產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBL)大腸桿菌、產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBL)肺炎克雷伯桿菌)在孵育體系中混勻后,置于37℃恒溫水浴箱孵育2小時(shí),瓊脂鋪板后置于37℃恒溫培養(yǎng)18~24h。然后記錄每一瓊脂板上菌落形成數(shù)量(CFU),并計(jì)算衍生多肽P-KKK作用后的殺菌率。結(jié)果:(1)衍生肽P-KKK對三種G~+菌標(biāo)準(zhǔn)株有較強(qiáng)的殺菌活性,其中對枯草芽孢桿菌殺菌活性最強(qiáng),對金黃色葡萄球菌及屎腸球菌殺菌活性無明顯差別。濃度在200ug/mL時(shí),能殺滅全部的G~+菌,在40ug/mL殺菌率也達(dá)92.4%。對三種G~—菌標(biāo)準(zhǔn)株也有較強(qiáng)的殺菌活性,其中對肺炎克雷伯桿菌殺菌活性最強(qiáng),對大腸桿菌及綠膿桿菌殺菌活性無明顯差別。濃度在200ug/mL時(shí),能殺滅96.5%的G~—菌,在40ug/mL殺菌率也在20%-96.4%范圍內(nèi)。(2)衍生多肽P-KKK對2種臨床分離G~+菌耐藥株具有較強(qiáng)的殺菌活性,濃度在40ug/mL時(shí),能殺滅99.7%的MRSA金黃色葡萄球菌,及99.9%的HLGR屎腸球菌。對2種臨床分離G~—菌耐藥菌株也具有較強(qiáng)的殺菌活性,當(dāng)肽分子P-KKK濃度達(dá)200ug/mL時(shí),能殺滅99.9%的ESBL大腸桿菌及ESBL肺炎克雷伯桿菌。濃度在40ug/mL時(shí),對ESBL大腸桿菌的殺菌活性為17.3%,對ESBL肺炎克雷伯桿菌的殺菌活性為61.3%。(3)衍生多肽P-KKK對常見細(xì)菌標(biāo)準(zhǔn)株及臨床分離的耐藥菌株殺菌活性無明顯差異,而抗生素對標(biāo)準(zhǔn)菌株的殺菌活性比對耐藥菌株殺菌活性強(qiáng)100倍左右。結(jié)論:(1)大腸桿菌OmpA信號肽衍生多肽P-KKK對常見的G~+菌及G~—菌標(biāo)準(zhǔn)株均具有明顯的殺菌活性。對G~+菌的殺菌活性稍強(qiáng)于G~—菌的殺菌活性。對G~+菌中的枯草芽孢桿菌殺菌活性最強(qiáng),對G~—菌的肺炎克雷伯桿菌活性最強(qiáng)。(2)枯草芽孢桿菌對衍生肽P-KKK分子及課題組前期研究的M17及C26等抗菌肽分子的敏感性明顯強(qiáng)于其他類型G~+菌,與枯草芽孢桿菌的某些結(jié)構(gòu)更容易受到肽分子攻擊有關(guān)。(3)大腸桿菌OmpA信號肽衍生多肽P-KKK對臨床分離耐藥菌株也具有較強(qiáng)殺菌活性,與對標(biāo)準(zhǔn)菌株殺菌活性無明顯差異。而抗生素對標(biāo)準(zhǔn)菌株及臨床分離的耐藥菌株殺菌活性差異明顯,抗生素對標(biāo)準(zhǔn)菌株的殺菌活性比對耐藥菌株殺菌活性強(qiáng)約100倍。提示衍生肽P-KKK具有廣譜的殺菌活性和獨(dú)特的殺菌機(jī)制,進(jìn)一步對衍生多肽P-KKK進(jìn)行結(jié)構(gòu)和功能的研究,將可能有助于研發(fā)出對耐藥菌株敏感同時(shí)又不易產(chǎn)生耐藥性的新型抗菌藥物。
【圖文】：

16圖 2-1 衍生肽 P-KKK 分子 HPLC 分析報(bào)告圖Figure 2-1 HPLC analysis report of peptide P-KKK.1.3 大腸桿菌 OmpA 信號肽衍生肽 P-KKK 的保存使用前將衍生肽凍干粉（4mg）離心，使其全部沉于試管底部，溶解于

金黃色葡萄球菌經(jīng)革蘭染色后在油鏡下所觀察到的形態(tài)
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R96

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6 王s

本文編號：2633423