【摘要】：背景:念珠菌引起的真菌感染在近些年來連續(xù)不斷發(fā)生。在念珠菌中,白色念珠菌所致疾病是最常見。臨床上,用來醫(yī)治念珠菌病的藥物種類有限且部分副作用大價格高。唑類藥物高效低毒,廣泛用于念珠菌感染,但隨著感染的增多和用藥量的增加,耐藥株開始不斷出現(xiàn)。為克服菌株的耐藥性,現(xiàn)有藥物增敏劑的研究受到了廣泛關注。質(zhì)子泵抑制劑(Proton pump inhibitors,PPIs)被發(fā)現(xiàn)可抑制白色念珠菌菌絲形成,且與氟康唑在臨床聯(lián)用可治愈念珠菌引起的急性食管壞死和念珠菌食管炎。盡管部分研究發(fā)現(xiàn)質(zhì)子泵抑制劑聯(lián)合氟康唑在體外無協(xié)同對抗敏感白色念珠菌的效應,但有研究發(fā)現(xiàn)D-octapeptide作為一種PPIs可增強氟康唑?qū)δ退幍陌咨钪榫投及亓帜钪榫淖饔?提示PPIs可作為氟康唑增敏劑的可能。迄今為止,沒有研究證實PPIs能否增強氟康唑?qū)δ退幇咨钪榫淖饔�。目�?本研究的目的是評價質(zhì)子泵抑制劑聯(lián)合氟康唑抗耐藥白色念珠菌浮游菌和預形成生物膜的體外藥物相互作用,建立大蠟螟幼蟲感染模型評價藥物組合的體內(nèi)相互作用,并深入探討藥物相互作用可能的機制。方法:首先,根據(jù)肉湯微量稀釋法評價PPIs單用或聯(lián)合氟康唑應用對抗耐藥白色念珠菌的最低抑菌濃度,藥物相互作用的結(jié)果采用分數(shù)抑制濃度指數(shù)(fractional inhibitory concentration index,FICI)模型和△E模型進行評價。進一步研究,采用XTT實驗方法測定藥物聯(lián)合應用在體外對耐藥白色念珠菌預形成生物膜的抗真菌作用。其次,采用大蠟螟幼蟲感染模型,進行耐藥白色念珠菌感染和藥物干預,觀察幼蟲的存活率和病理學組織切片,評價藥物聯(lián)合在體內(nèi)的抗真菌效應。最后,采用羅丹明6G實驗測定藥物干預后耐藥白色念珠菌外排泵活性,采用卵黃培養(yǎng)基測定藥物干預后磷脂酶的活性,并通過顯微鏡觀察藥物組合對菌株菌絲生成的影響,探索藥物聯(lián)合潛在的抗真菌機制。結(jié)果:1.PPIs協(xié)同氟康唑體外對抗耐藥白色念珠菌六種PPIs抗真菌活性較弱,但聯(lián)合氟康唑體外抗耐藥白色念珠菌浮游菌時,均可顯著將氟康唑的最小抑菌濃度從512μg/mL降低至0.5-4μg/mL,計算所得FICI數(shù)據(jù)值在0.03-0.13之間,遠小于0.5;所得∑△E值均為正值,其絕對值遠大于200%。兩種非參數(shù)模型評價所得結(jié)果相同,即藥物相互作用結(jié)果被判定為強烈的協(xié)同效應。此外,六種質(zhì)子泵抑制劑自身固有的的抗念珠菌活性和聯(lián)合氟康唑的協(xié)同作用不盡相同。2.PPIs協(xié)同氟康唑抗耐藥白色念珠菌的體外預培養(yǎng)生物膜對抗預形成時間較短的生物膜時,六種PPIs均可顯著降低氟康唑的最小抑菌濃度,FICI值在0.06-0.25之間,均小于0.5,為強協(xié)同抗生物膜作用,且六種PPIs與氟康唑的協(xié)同抗生物膜作用不盡相同。對抗預形成時間為24 h的生物膜時,氟康唑的最小抑菌濃度均無明顯降低,FICI值均為2,顯示出無關的藥物相互作用。3.PPIs聯(lián)合氟康唑可增加大蠟螟存活率并減少其組織損傷實驗所得生長對照組的大蠟螟存活率為25%,氟康唑與PPIs單用組的存活率在20%-35%之間,藥物聯(lián)用組的存活率在70%-85%之間。與氟康唑組相比,藥物聯(lián)用可明顯提高感染的幼蟲存活率(P0.05)。此外,在對照組和藥物單用組中,可明顯觀察到面積較大的黑褐色菌團塊散落在組織各處,而藥物聯(lián)用組的大蠟螟幼蟲組織較為細密完整,且黑色團塊面積較小,數(shù)量也較少。4.PPIs不影響耐藥CA10藥物外排泵活性與對照組比較,加有OME、LAN、PTP、RAB和ESO實驗組的熒光強度變化無明顯區(qū)別(P0.05),說明這五種質(zhì)子泵抑制劑對CA10的外排泵活性無明顯作用。加有ILA的加藥組中,其胞內(nèi)熒光強度下降程度明顯強于對照組(P0.001),說明ILA可能促進了 CA10的外排泵活性,也可能是因為溶解度小生成的藥物顆粒產(chǎn)生了熒光干擾了結(jié)果測定。5.PPIs聯(lián)合氟康唑抑制白色念珠菌CA10磷脂酶活性和形態(tài)轉(zhuǎn)變磷脂酶活性結(jié)果顯示:藥物聯(lián)用組的Pz值為0.87±0.01,而未添加藥物的對照組和藥物單用組的Pz值均0.69。與對照組相比,藥物單獨使用組的Pz值與之非常相近,無統(tǒng)計學意義(P0.05);與其他組相比較而言,聯(lián)合用藥組均具備顯著性差別(P0.0001)。在菌絲生長方面,藥物聯(lián)用組的菌絲長度明顯比生長對照組和藥物單用組短,且偶見圓形或卵圓形的酵母形態(tài)細胞。結(jié)論:PPIs可增強氟康唑的體內(nèi)外抗耐藥念珠菌活性,且可與氟康唑協(xié)同抗耐藥念珠菌預形成的生物膜。機制研究結(jié)果提示,藥物聯(lián)合的協(xié)同抗真菌作用與抑制菌株磷脂酶活性和形態(tài)轉(zhuǎn)變有關,可能與藥物的外排泵活性無關。此研究將為抗真菌藥物的研究和發(fā)現(xiàn)及克服真菌耐藥性提供實驗數(shù)據(jù)與新的研究思路。
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R96

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本文編號：2629986