【摘要】：鉤吻素子具有重大新藥開(kāi)發(fā)價(jià)值,但其作用靶點(diǎn)以及作用方式有待研究。轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(18 kDa)[translocator protein(18 kDa),TSPO],有望成為治療神經(jīng)精神疾病等疾病重要的藥物作用靶點(diǎn)。本課題組先前和同期研究提示,鉤吻素子對(duì)TSPO可能存在正性別構(gòu)調(diào)節(jié)作用,但有待于論證。近年來(lái),人們?nèi)找嬷匾暶鈽?biāo)記的生物分子間相互作用技術(shù)的應(yīng)用,其中表面等離子共振(surface plasmon resonance,SPR)技術(shù)作為一種新型的免標(biāo)記、實(shí)時(shí)在線研究生物分子間相互作用的高靈敏傳感技術(shù),可實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)分析藥物對(duì)膜蛋白的親和力和相互作用的動(dòng)力學(xué)變化,已應(yīng)用于別構(gòu)調(diào)節(jié)的研究,與放射配體結(jié)合分析法可相互印證,并彌補(bǔ)后者需要同位素標(biāo)記的內(nèi)源性配體的局限性。鑒此,本文首先采用分子對(duì)接分析TSPO與鉤吻素子是否存在結(jié)合的可能。在此基礎(chǔ)上,建立SPR技術(shù),檢測(cè)鉤吻素子與TSPO結(jié)合的親和力,探索鉤吻素子能否增強(qiáng)TSPO正位配體與人源TSPO重組蛋白、鼠源TSPO重組蛋白的親和力,從化學(xué)生物學(xué)角度進(jìn)一步論證鉤吻素子對(duì)TSPO存在別構(gòu)調(diào)節(jié)。主要研究?jī)?nèi)容如下:1.分子對(duì)接分別計(jì)算PK11195、鉤吻素子與TSPO的親和力基于分子對(duì)接技術(shù),用AutoDock程序計(jì)算TSPO與其配體PK11195親和力大小。分子對(duì)接技術(shù)結(jié)果顯示,配體PK11195與TSPO親和力57.31μM,主要通過(guò)范德化力、疏水作用進(jìn)入蛋白的活性中,活性中心處的PRO18,ALA19,THR20,THR21,GLY22,ALA23,LEU25,LYS26,PRO27,ARG43,TRP44,PHE46,PRO47,TRP50,THR51,THR54,PHE92等氨基酸與PK11195相互作用。鉤吻素子與TSPO親和力為25.34μM,主要通過(guò)范德化力、疏水作用進(jìn)入蛋白的活性中,TSPO活性中心處的GLY22,ALA23,LEU24,LEU25,LYS26,PRO27,ARG43,TRP44,PHE46,PRO47,TRP50,PHE92等氨基酸與鉤吻素子相互作用。2.鉤吻素子對(duì)人源TSPO重組蛋白與其正位配體親和力的影響2.1鉤吻素子及TSPO正位配體與人源TSPO重組蛋白的親和力采用SPR技術(shù),通過(guò)在CM5芯片上氨基偶聯(lián)人源TSPO重組蛋白,測(cè)得TSPO外源性配體PK11195、外源性配體Ro5-4864、內(nèi)源性配體PPIX與人源TSPO重組蛋白結(jié)合的K_D值分別為199.77±0.12μM、176.93±2.70μM、156.93±5.50μM,進(jìn)一步檢測(cè)鉤吻素子與人源TSPO重組蛋白結(jié)合的K_D值為155.33±11.0μM。2.2測(cè)定鉤吻素子對(duì)人源TSPO重組蛋白與其正位配體親和力的影響分別依次測(cè)定運(yùn)行緩沖液中含有10~(-11)、10~(-10)、10~(-9)、10~(-8)、10~(-7)、10~(-6)、10~(-5)、10~(-4)、10~-33 M鉤吻素子時(shí),濃度為0.1 K_D值即20.0μM PK11195、17.7μM Ro5-4864、15.7μM原卟啉IX二鈉鹽流過(guò)蛋白固定通道和參比通道時(shí)的響應(yīng)信號(hào)。結(jié)果顯示當(dāng)鉤吻素子濃度分別為10~(-5)、10~(-7)與10~(-6) M時(shí),PK11195、Ro5-4864及PPIX與TSPO相互作用的響應(yīng)值達(dá)到最大值。采用多循環(huán)動(dòng)力學(xué)檢測(cè)在10~(-5) M鉤吻素子存在的條件下,PK11195與人源TSPO重組蛋白結(jié)合的K_D值為95.27±0.62μM,對(duì)比運(yùn)行緩沖液不含鉤吻素子的PK11195與人源TSPO重組蛋白結(jié)合的K_D值,鉤吻素子能夠明顯增強(qiáng)PK11195與人源TSPO重組蛋白結(jié)合的K_D值,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001);10~-77 M鉤吻素子存在的條件下,Ro5-4864與人源TSPO重組蛋白結(jié)合的K_D值為77.73±0.87μM。對(duì)比運(yùn)行緩沖液不含鉤吻素子的Ro5-4864與人源TSPO重組蛋白結(jié)合的K_D值,鉤吻素子能夠明顯增強(qiáng)Ro5-4864與人源TSPO重組蛋白結(jié)合的K_D值,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001);10~-66 M鉤吻素子存在的條件下,測(cè)得PPIX與人源TSPO重組蛋白結(jié)合的K_D值為66.07±3.32μM。對(duì)比運(yùn)行緩沖液不含鉤吻素子的PPIX與人源TSPO重組蛋白結(jié)合的K_D值,鉤吻素子能夠明顯增強(qiáng)PPIX與人源TSPO重組蛋白結(jié)合的K_D值,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001)。3.鉤吻素子對(duì)鼠源TSPO重組蛋白與其正位配體親和力的影響3.1鉤吻素子及TSPO正位配體與鼠源TSPO重組蛋白的親和力通過(guò)原核表達(dá)獲得鼠源TSPO重組蛋白,經(jīng)Ni~(2+)親和色譜柱純化蛋白并通過(guò)Western blot對(duì)蛋白進(jìn)行初步表征。利用SPR技術(shù),通過(guò)捕獲帶有His標(biāo)簽的鼠源TSPO重組蛋白來(lái)固定蛋白。測(cè)定TSPO外源性配體PK11195、TSPO外源性配體Ro5-4864、TSPO內(nèi)源性配體PPIX與鼠源TSPO重組蛋白結(jié)合的K_D值分別為161.33±6.1μM、169.75±6.07μM、95.85±4.36μM,進(jìn)一步檢測(cè)鉤吻素子與鼠源重組TSPO蛋白結(jié)合的K_D值為97.37±1.76μM。3.2測(cè)定鉤吻素子對(duì)鼠源TSPO重組蛋白與其正位配體親和力的影響分別依次測(cè)定運(yùn)行緩沖液中含有10~(-11)、10~(-10)、10~(-9)、10~(-8)、10~(-7)、10~(-6)、10~(-5)、10~(-4)、10~-33 M鉤吻素子時(shí),濃度為0.1K_D值即16.1μM PK11195、17.0μM Ro5-4864、9.6μM原卟啉IX二鈉鹽流過(guò)鼠源TSPO重組蛋白固定通道和參比通道時(shí)響應(yīng)信號(hào)。結(jié)果顯示當(dāng)鉤吻素子濃度分別為10~(-7)、10~(-6)與10~-77 M時(shí),PK11195、Ro5-4864及PPIX與鼠源TSPO重組蛋白相互作用的響應(yīng)值達(dá)到最大值。采用多循環(huán)動(dòng)力學(xué)檢測(cè)在10~(-7) M鉤吻素子存在的條件下,PK11195與鼠源TSPO重組蛋白結(jié)合的K_D值為95.32±1.80μM,對(duì)比運(yùn)行緩沖液不含鉤吻素子的PK11195與鼠源TSPO重組蛋白結(jié)合的K_D值,鉤吻素子能夠明顯增強(qiáng)PK11195與鼠源TSPO重組蛋白結(jié)合的K_D值,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001);10~(-6)M鉤吻素子存在的條件下,Ro5-4864與鼠源TSPO重組蛋白結(jié)合的K_D值為67.68±11.09μM。對(duì)比運(yùn)行緩沖液不含鉤吻素子的Ro5-4864與鼠源TSPO重組蛋白結(jié)合的K_D值,鉤吻素子能夠明顯增強(qiáng)Ro5-4864與鼠源TSPO重組蛋白結(jié)合的K_D值,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001);10~-77 M鉤吻素子存在的條件下,測(cè)得PPIX與鼠源TSPO重組蛋白結(jié)合的K_D值為39.87±3.87μM。對(duì)比運(yùn)行緩沖液不含鉤吻素子的PPIX與鼠源TSPO重組蛋白結(jié)合的K_D值,鉤吻素子能夠明顯增強(qiáng)PPIX與鼠源TSPO重組蛋白結(jié)合的K_D值,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001)。4.鉤吻素子對(duì)TSPO正位配體與鼠源TSPO脂蛋白體親和力的影響結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn),我們首次利用SPR技術(shù),采用芯片表面重構(gòu)的方法研究PK11195及鉤吻素子與鼠源TSPO脂蛋白體親和力。測(cè)得PK11195與鼠源TSPO重組蛋白的K_D值為8.04±1.42 nM,進(jìn)而檢測(cè)鉤吻素子與鼠源TSPO重組蛋白的K_D值為0.61±0.11 nM。后期工作將用表面重構(gòu)法繼續(xù)測(cè)定鉤吻素子對(duì)于TSPO正位配體與TSPO親和力的影響。本文研究結(jié)果提示,可用SPR技術(shù)檢測(cè)鉤吻素子以及TSPO正位配體與TSPO結(jié)合的親和力,分析鉤吻素子對(duì)TSPO正位配體與TSPO蛋白親和力的影響;鉤吻素子可顯著增強(qiáng)TSPO正位配體PK11195、Ro5-4864或PPIX與TSPO的親和力,提示鉤吻素子對(duì)TSPO存在正性別構(gòu)調(diào)節(jié)。
【圖文】：

前 言位蛋白(the translocator protein，TSPO)過(guò)去稱(chēng)之為外er．a(chǎn)lbenzodiazepine receptor，PBR)，是 1977 年 B合實(shí)驗(yàn)中用大鼠外周組織作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central)的陰性對(duì)照時(shí)，，意外發(fā)現(xiàn)并確認(rèn)的[1-3]。PBR 內(nèi)含 粒體外膜的異喹啉結(jié)合點(diǎn)、結(jié)合苯二氮革類(lèi)藥物的嘌吟核苷載體。隨著對(duì) PBRs 結(jié)構(gòu)與功能研究深入氮卓的結(jié)合位點(diǎn)，但其與中樞型苯二氮卓受體無(wú)論還是生理功能和作用機(jī)制上都不同。2006 年 PapadPBRs，把原先稱(chēng)為 PBRs 的異喹啉結(jié)合點(diǎn)亞單位改反映其功能及組織分布，并得到了大多數(shù)學(xué)者的認(rèn) 1.1 所示。

圖 1.2 典型的分子相互作用的 SPR 傳感圖譜Fig.1.2 Typical schematic of kinetic analyses of bioaffinity interactions using SPR spectroscopyTSPO 參與生命活動(dòng)中的很多生理過(guò)程，TSPO 的異常表達(dá)與許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生有著直接關(guān)系[58]，因此 TSPO 已經(jīng)成為重要的藥物靶點(diǎn)。如上推測(cè)，課題組前期系列工作提示鉤吻素子可能是 TSPO 的正性別構(gòu)調(diào)節(jié)劑。鑒于Biacore 可實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)分析藥物對(duì)膜蛋白的親和力和相互作用的動(dòng)力學(xué)變化且已應(yīng)用于別構(gòu)調(diào)節(jié)的研究，與放射配體結(jié)合分析法可相互印證，并彌補(bǔ)后者需要同位素標(biāo)記的內(nèi)源性配體的局限性。本研究采用 SPR 技術(shù)，在分子水平從影響配體親和力的角度，探索鉤吻素子對(duì) TSPO 別構(gòu)調(diào)節(jié)的規(guī)律。基于以上情況，本文首先采用分子對(duì)接計(jì)算 TSPO 與其配體 PK11195 的親和力以及 TSPO 與鉤吻素子的親和力，分析 TSPO 與鉤吻素子是否存在結(jié)合的可能。在此基礎(chǔ)上，建立 SPR 技術(shù)，檢測(cè)鉤吻素子以及 TSPO 正位配體與 TSPO 結(jié)合的親和力，探索鉤吻素子能否增強(qiáng) TSPO 正位配體與人源 TSPO 重組蛋白、鼠
【學(xué)位授予單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R96

【參考文獻(xiàn)】

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1 高明雅;沈偉哉;吳顏暉;曹長(zhǎng)姝;張冬梅;高江暉;;鉤吻生物堿單體對(duì)肝癌細(xì)胞體外抑制作用機(jī)制的初步研究[J];中藥材;2012年03期

2 張秋萍;張彬鋒;O垂鸚

本文編號(hào)：2626862