【摘要】：背景目前臨床治療惡性腫瘤多采用綜合手段,有手術(shù)、放射治療、化學(xué)治療。癌癥的治療中,藥物治療是一個很重要的環(huán)節(jié),有效的抗癌藥物的使用,可以幫助患者獲得更長的生存時間,增加生存率。在上世紀60年代,聯(lián)合化療興起,即在一個化療療程中同時或者先后使用數(shù)種化療藥物,是多種癌癥治療中廣為使用的策略。目前,臨床多種癌癥治療都有聯(lián)合化療方案�；诼�(lián)合化療的理念,癌癥治療中共遞藥的研究越來越多。從所使用的藥物的結(jié)構(gòu)來分,可以是兩種或多種小分子藥物的共同遞送,也可以是小分子藥物與大分子藥物的共同遞送;從模式藥物的作用機理來分,可以與聯(lián)合化療相同,即兩種或多種藥物均為抗癌藥物,也可以是抗癌藥物與增敏劑的組合遞藥。近幾年,在癌癥治療的研究中,共同遞送化療藥物與化療增敏劑的研究越來越多�；熢雒艋蚨嗨幠退幠孓D(zhuǎn)作用是指采用微小劑量的該種物質(zhì)與化療藥物合用即能使化療效果有顯著提高。現(xiàn)今的化療增敏劑主要包括:多藥耐藥(Multidrug Resistance,MDR)逆轉(zhuǎn)劑,乏氧細胞殺傷劑,基因制劑,中藥及其提取物等等。其中P-gp蛋白抑制劑的研究較為成熟,目前已出現(xiàn)第三代P-pg抑制劑�；谧允烧T導(dǎo)的原理,抗癌藥物聯(lián)合自噬抑制劑的研究在最近幾年也開始受到關(guān)注。自噬誘導(dǎo)是腫瘤細胞對化療藥物抵抗性的原因之一,當腫瘤細胞受到化療藥物刺激時細胞內(nèi)自噬水平會明顯增加,這是腫瘤細胞逃避化療刺激的一種適應(yīng)性反應(yīng)。因此自噬能使腫瘤細胞對化療藥物產(chǎn)生耐受,抑制自噬將會增加腫瘤對化療藥物的敏感性。臨床上,有用細胞毒化療藥物加自噬抑制劑用于聯(lián)合化療的治療方法。結(jié)合自噬抑制形成的抗癌增敏效果,以及納米遞藥系統(tǒng)的優(yōu)勢,載有自噬抑制劑及抗癌藥物的納米共遞藥系統(tǒng),可減少抗癌藥物的使用劑量以及毒副作用,提高抗癌效果,逆轉(zhuǎn)多藥耐藥。實驗?zāi)康奈覀冊O(shè)計并制備了一種單層雙載藥的納米顆粒,命名為NPDOX+CQ。該納米顆粒荷載兩種藥物,一種為抗癌藥DOX,另一種為自噬抑制劑CQ。我們證實,NPDOX+CQ可阻止藥物被P-gp識別和外排,在癌細胞的次級胞內(nèi)體釋放藥物,CQ阻斷自噬過程,使DOX得到保護,進而更多的分布到細胞核中。此外,我們還研究了納米顆粒在胞內(nèi)的具體轉(zhuǎn)運過程,以及其對自噬相關(guān)蛋白表達的影響。該納米顆粒為克服MDR提供了一種有效的策略。實驗方法1.制備表征:采用乳化溶劑揮發(fā)法制備PLGA/TPGS NPs以及NPDOX,NPCQ和NPDOX+CQ。對幾種納米顆粒的粒徑和表面電位進行分析。通過掃描電子顯微鏡和透射電子顯微鏡觀察納分別觀察幾種納米顆粒的表面形態(tài)和分散情況。通過漫反射傅里葉變換紅外光譜(DR-FTIR)和X射線衍射(X-RD)檢測藥物的包載情況。使用UV-Vis分光光度計檢測納米顆粒的包封率和載藥率,以及體外釋放的情況。2.生物效應(yīng):利用WST-1的方法測定PLGA/TPGS NPs對A549和A549/Taxol細胞的細胞毒性,以評估材料的安全性。用WST-1試劑盒分別測定DOX、DOX+CQ、NPDOX和NPDOX+CQ對A549和A549/Taxol細胞的細胞毒性,并計算IC50值,以評估納米共遞藥系統(tǒng)對藥物抗癌效果的改善情況。3.細胞攝取與遷移:制備NPDOX+C6,用C6代替沒有熒光特性的CQ,標記納米顆粒。用激光共聚焦顯微鏡觀察比較游離DOX在A549和A549/Taxol細胞中的外排情況,以及NPDOX+C6在A549/Taxol細胞中的攝取與遷移。4.機理研究:用NPC6分別處理DsRed-Rab5質(zhì)粒和DsRed-Rab7質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的A549/Taxol細胞,用激光共聚焦顯微鏡觀察納米顆粒入胞后的轉(zhuǎn)運情況,即納米顆粒與兩種熒光蛋白的位置關(guān)系。用Western Blot檢測不同組藥物處理后,A549/Taxol細胞LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ的蛋白表達情況以及對各組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值的比較。結(jié)果1.檢測結(jié)果顯示,納米顆粒粒徑均一且分散性良好,雙載藥納米顆粒約為170nm。納米顆粒帶有負電荷,利于其在體內(nèi)的運輸。紅外和X衍射的結(jié)果顯示,兩種藥物被成功載入納米顆粒中。納米顆粒對兩種藥物都有較高的包封和載藥效率。體外藥物釋放實驗則顯示,納米顆粒具有pH敏感性,可在弱酸性的次級胞內(nèi)體中釋放藥物。2.體外細胞毒性實驗的結(jié)果表明,納米遞藥材料對A549和A549/Taxol兩種細胞的細胞毒性很低,證明該材料基本是安全的。而藥物的細胞毒性結(jié)果則表明,聯(lián)合遞送抗癌藥物DOX及其增敏劑CQ,可改善抗癌療效,減少藥物的使用劑量,降低毒副作用。3.藥物外排實驗結(jié)果顯示,游離的DOX可進入A549細胞的細胞核,但最終也有少量外排。而對于A549/Taxol細胞而言,游離DOX不可進入其細胞核,只在2h-6h時靠近其細胞核,但最終又被外排出細胞。制備NPDOx+C6用于熒光成像。結(jié)果顯示,兩種藥物被遞送到A549/Taxol細胞中。從6h-24h表明越來越多的DOX遷移并聚積到細胞核內(nèi)。這表明,納米顆�？杀苊釶-gp底物的藥物外排,利于其在細胞核內(nèi)的聚積。4.機理研究結(jié)果表明,納米顆粒進入細胞后通過自噬流進行轉(zhuǎn)運。CQ可在自噬晚期發(fā)揮作用,保護DOX免受降解,使其更多的進入細胞核發(fā)揮抗癌作用。WesternBlot結(jié)果顯示,與其他各組制劑相比,雙載藥納米顆粒組具有最好的自噬抑制效果,可使DOX最大限度的發(fā)揮其藥效,改善抗癌效果。結(jié)論在本研究中,我們設(shè)計并制備了單層雙載藥的納米顆粒,荷載了抗癌藥物DOX以及自噬抑制劑CQ。CQ作為DOX的抗癌增敏劑,可阻止次級胞內(nèi)體與溶酶體的結(jié)合,在納米顆粒通過自噬流轉(zhuǎn)運的過程中,保護DOX使其不被細胞自噬過程降解,從而更多的聚積于細胞核中,殺滅腫瘤細胞。減少了抗癌藥物的使用劑量,減少了毒副作用,提高了抗癌效果,逆轉(zhuǎn)了多藥耐藥。
【圖文】：

圖４邋ＰＬＧＡ／ＴＰＧＳ邋ＮＰｓ的Ｘ射線衍射圖彟逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋４邋Ｘ－ＲＤ邋ｏｆ邋ＰＬＧＡ／ＴＰＧＳ邋ＮＰｓ逡逑結(jié)果表明，本次實驗所采用的制備方法可以制備出結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、大小適宜逡逑Ａ／ＴＰＧＳ邋ＮＰｓ。對ＰＬＧＡ／ＴＰＧＳ邋ＮＰｓ的表面形態(tài)進行電鏡檢測，，可觀察到逡逑粒為表面光滑的球狀結(jié)構(gòu)。結(jié)合投射電鏡以及動態(tài)光散射實驗結(jié)果，可得逡逑顆粒直徑約為２００邋ｎｍ左右。Ｚｅｔａ電位測量結(jié)果表明，其表面帶有一定逡逑，這種負電性有利于該納米顆粒在血液中的運輸。Ｘ射線衍射分析和傅逡逑光譜鑒定圖譜都確證了邋ＰＬＧＡ／ＴＰＧＳＮＰｓ的成分與結(jié)構(gòu)，這些為接下來逡逑Ｘ及氯喹共遞藥的研究奠定了基礎(chǔ)。逡逑

圖５ＤＯＸ和ＣＱ的結(jié)構(gòu)圖逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋５邋Ｃｈｅｍｉｃａｌ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ邋ｏｆ邋ＤＯＸ邋ａｎｄ邋Ｃ0逡逑材料逡逑驗試劑逡逑邋（５０：邋５０，邋Ｍｗ邋＝邋３０邋０００）邐山東濟南岱罡生物科技有限（Ｍｗ＝１５１３）邐美國邋Ｓｉｇｍａ邋北京百靈威科技有限公日本ＴＣＩ水邐經(jīng)Ｍｉｌｌｉ－Ｑ超純水系統(tǒng)驗儀器逡逑邋純水機邐ＭｉｌｌｉＰｏｒｅ邋１，ＡＲ２１４０電子分析天平邐美特勒一托力多儀器有限型低溫高速離心機邐德國埃普多夫８Ｓ冷凍干燥機邐北京松源華興科技發(fā)展有限公９９旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀邐鞏義市予華儀器有限公
【學(xué)位授予單位】：南京師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R943;R96

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本文編號：2625312