發(fā)布時(shí)間：2020-04-12 05:01

【摘要】：水稻是高度自花授粉的作物,由于它不含有任何有害成分,因此是美國聯(lián)邦食品藥品管理局(FDA)公認(rèn)的安全(General recognized as safe,GRAS)植物。已經(jīng)證明水稻胚乳作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)醫(yī)用蛋白閂具有成本低、提取純化工藝簡單、規(guī)�；菀�、安全性好等優(yōu)勢,因此它可以成為重組蛋白質(zhì)藥物的最好平臺(tái)之一。雖然植物技術(shù)平臺(tái)相對(duì)于微生物和動(dòng)物細(xì)胞技術(shù)平臺(tái)具有較多的優(yōu)勢,但利用植物生物反應(yīng)器生產(chǎn)醫(yī)藥產(chǎn)品(plant-made pharmaceutical,PMP)的植物源生物藥物的安全性較為關(guān)注。通常,影響生物藥物的安全性主要來源于與宿主相關(guān)、藥物相關(guān)和加工相關(guān)雜質(zhì),由于植物細(xì)胞的重組蛋白的糖苷修飾與人類具有相似的糖骨架,但在巖藻糖和木糖的修飾存在差異,因此植物糖修飾的免疫原性成為與藥物相關(guān)的雜質(zhì),是水稻胚乳細(xì)胞生產(chǎn)生物醫(yī)藥的關(guān)鍵因子之一�，F(xiàn)有研究結(jié)果表明水稻胚乳表達(dá)OsrHSA具有高效、穩(wěn)定和經(jīng)濟(jì)有效,水稻種子中蛋白N-糖基化模式較為簡單。由于不同的蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)具有糖苷修飾差異,植物中生產(chǎn)的生物藥物的糖基化將植物特異性N-聚糖殘基,αa-1,3-巖藻糖和β-1,2-木糖添加到最終的糖基化產(chǎn)物中。這些植物特異性N-聚糖的存在可以顯著改變生物藥物的穩(wěn)定性和活性,一些研究已經(jīng)證明,通過基因工程在植物中通過人源糖基化類型生產(chǎn)藥物可以改變植物細(xì)胞的N-糖基化結(jié)構(gòu)。人血漿主要由人血清白蛋白的蛋白質(zhì)組成,它是一種單體非糖基化蛋白質(zhì)。它常以高劑量用于治療各種疾病和傷害,如手術(shù)失血,血容量不足,嚴(yán)重?zé)齻纫鸬呢氀�。作為血漿來源的HSA替代物,重組人血清白蛋白是一種安全性高并且供應(yīng)來源廣泛的生物制藥。中國已經(jīng)在轉(zhuǎn)基因水稻胚乳中大規(guī)模生產(chǎn)了的植物源重組人血清白蛋白(human serum albumin from Oryza Sativa,OsrHSA)OsrHSA,并且最近中國食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)它在中國進(jìn)行臨床試驗(yàn),OsrHSA的HCPs安全性則是其中的一個(gè)關(guān)鍵問題。研究結(jié)果表明:OsrHSA與血漿來源人血白蛋白(Plasma HSA)在理化和物理性質(zhì)上完全相同或相似。因此,OsrHSA的安全性問題不是來自HSA木身,而是來自O(shè)srHSA加工過程中產(chǎn)生的雜質(zhì),尤其是殘留宿主細(xì)胞蛋白(Host Cell Proteins,HCPs)。但是HCP不可能在下游加工過程中徹底去除。雖然OsrHSA中的殘留HCP控制在低至1.5|μg/g的濃度,但由于HSA在臨床應(yīng)用中臨床劑量超過50克以上,總HCP含量仍然很高。通常,生物藥的安全性不僅受HCP水平,還受其種類的影響。雖然許多復(fù)雜方法已被用于去除和降低HCPs含量,但由于不能完全排除這些雜質(zhì),殘留HCPs作為關(guān)鍵質(zhì)量屬性(Critical Quality Attributes,CQA)之一。而HCPs潛在的免疫原性是在OsrHSA臨床應(yīng)用中最關(guān)注的風(fēng)險(xiǎn)。因此,將OsrHSA中殘留的HCPs作為CQA的表征以及通過不同方法評(píng)估免疫原性非常重要。目前為止,關(guān)于OsrHSA中HCPs的免疫原性尚沒有報(bào)道,對(duì)殘留HCPs的免疫原性在臨床前或臨床試驗(yàn)的相關(guān)研究也未見報(bào)道。因此,利用動(dòng)物系統(tǒng)的臨床前試驗(yàn)研究獲得OsrHSA中的HCP的免疫原性和免疫毒性的直接證據(jù)顯得至關(guān)重要。在本研究中,針對(duì)水稻胚乳細(xì)胞生物反應(yīng)器的蛋白藥物中與宿主相關(guān)的主要成分之一 HCPs安全性和與藥物相關(guān)的植物類型N-糖苷的人源化進(jìn)行了研究。首先,我們使用Sprague-Dawley大鼠評(píng)估了 OsrHSA及其殘留HCPs的免疫原性和細(xì)胞毒性進(jìn)行系統(tǒng)評(píng)價(jià),對(duì)包括對(duì)動(dòng)物主動(dòng)脈血樣進(jìn)行血液學(xué)和生化分析、細(xì)胞因子、C-反應(yīng)蛋白(CRP)和血漿循環(huán)免疫復(fù)合物、補(bǔ)體和抗藥物抗體(ADA)的等關(guān)鍵性安全指標(biāo)進(jìn)行了分析。然后采用TALENs基因組編輯技術(shù),對(duì)水稻胚乳細(xì)胞的人源化糖苷修飾進(jìn)行遺傳改造,以期獲得具有人源巖藻糖結(jié)構(gòu)和半乳糖、唾液酸結(jié)構(gòu)的糖苷結(jié)構(gòu)。在水稻基因組內(nèi)分別敲除α-1,3-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶(α-1,3-fucosyltransferase,OsFUT)或β-1,2-木糖基轉(zhuǎn)移酶(β-1,2-xylosyltransferase,OsXylT)基因,同時(shí)將人的巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶(FUT8)和人的半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶基因(GalT)導(dǎo)入水稻基因組。主要結(jié)果如下:HCP組或陰性對(duì)照組中均未觀察到動(dòng)物死亡或異常反應(yīng)。所有處理組的體重均有增加,但在D42與對(duì)照組未見明顯的體重增加。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),雄性動(dòng)物體重的上升趨勢遠(yuǎn)高于雌性動(dòng)物,而HCP組的體重與陰性對(duì)照組相比較并沒有顯著變化。在HCP和陰性對(duì)照血液學(xué)和凝血相關(guān)參數(shù)也沒有顯著差異。結(jié)果表明:與陰性對(duì)照相比,OsrHSA的殘留HCP不會(huì)引起任何血液生化的改變。對(duì)HCP的免疫毒性評(píng)估結(jié)果,通過監(jiān)測CD4+和CD8 + T細(xì)胞,結(jié)果發(fā)現(xiàn),在給藥后的D15,HCP組與陰性對(duì)照組相比時(shí),CD8 + T細(xì)胞沒有顯著差異。然而,給藥后的D15,CD4 + T細(xì)胞和CD4 +/CD8 + T細(xì)胞比例在HCP組中與陰性對(duì)照組之間存在顯著差異。盡管在D15的CD4 +/CD8+比例有實(shí)質(zhì)性差異,但淋巴細(xì)胞百分比仍處于臨床正常范圍,這些變化并未顯示藥物劑量與給藥時(shí)間之間的相關(guān)性。因此,我們并不認(rèn)為這些變化與這種藥物的免疫毒性有關(guān)。通過進(jìn)一步對(duì)與炎癥高度相關(guān)的IL-4,IL-5,IL-6,IL-10,IL-13,TNF-α,IFN-y和IL-1β等細(xì)胞因子進(jìn)行研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn)HCP組中沒有檢測到這8種細(xì)胞因了,表明OsrHSA的HCPs沒有免疫毒性,也不可能出現(xiàn)細(xì)胞因子風(fēng)暴的風(fēng)險(xiǎn)。為了研究水稻殘留HCP的免疫原性,我們研究了 HCP特異性抗體,在給藥后第14天,第28天和第41天分別檢測了抗HCP、抗人血清白蛋白和抗OsrHSA的特異性抗體的效價(jià)和發(fā)生率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在給藥后D41時(shí),只有少數(shù)動(dòng)物在OsrHSA和pHSA中檢測到HCP特異性抗體,其發(fā)生率為在2/10,滴度均小于1.0,盡管檢測到了特異性抗體,但發(fā)生率和滴度均較低,結(jié)果表明HCP具有較低的免疫原性。C-反應(yīng)蛋白(C-reaction protein,CRP)水平會(huì)隨著炎癥發(fā)展而增加。在給藥后D15時(shí),OsrHSA組的雄性動(dòng)物中CRP不但沒有升高,反而有顯著降低,并且在給藥后42天時(shí),OsrHSA和pHSA兩中的CRP都顯著降低。然而雌性動(dòng)物的CRP顯著降低;但這種變化與藥物和給藥時(shí)間之間沒有相關(guān)性。CIC水平的上升作為抗藥物抗體(Anti-drugantibody,ADA)發(fā)展的先決條件,我們檢測了HCP的ADA,我們?cè)诮o藥后D15和D42天分別檢測了CIC的水平。與陰性對(duì)照組相比,HCP組沒有觀察到任何與藥物相關(guān)的CIC變化。進(jìn)一步評(píng)估響應(yīng)于HCP抗原的免疫激活反應(yīng),我們檢測了補(bǔ)體3和補(bǔ)體4,結(jié)果表明:在pHSA組的補(bǔ)體3水平在給藥后D15和D42較對(duì)照顯著下降,而僅在給藥后D42時(shí),補(bǔ)充3水平僅在OsrHSA組的雌性動(dòng)物有所增高,但所有處理組均沒有檢測到補(bǔ)體4。為了探討在OsrHSA高劑量組可能引起的病理變化,我們對(duì)高劑量可能引起病理變化的肝、腎和脾臟等靶器官進(jìn)行了組織學(xué)觀察。在HCP組和陰性對(duì)照之間未觀察到與藥物相關(guān)的顯著病理學(xué)差異,也沒有發(fā)現(xiàn)HCP組的器官重量和系數(shù)比率的顯著變化。對(duì)pHSA和OsrHSA高劑量處理組的病理學(xué)觀察結(jié)果,在OsrHSA和pHSA組里發(fā)現(xiàn)了與藥物相關(guān)的包括肝、脾和腎的器官/體重比增加;在OsrHSA和pHSA組觀察到了肝細(xì)胞肥大,肝/脾造血,腎小球系膜細(xì)胞增殖和基質(zhì)擴(kuò)大,腎小管和腎小管變性/再生等在內(nèi)的病理學(xué)變化。其發(fā)生率和嚴(yán)重程度與劑量高度相關(guān),這可能是由于蛋白質(zhì)過載引起滲透壓增加從而降低肺功能所致,這些病變與每天高劑量注射白蛋白后的生物學(xué)特征一致。由于HSA主要用于治療低血容量患者,因此這種現(xiàn)象不可能發(fā)生在病人身上。除腎小管病變?cè)诮o藥后D43后沒有得到恢復(fù)外,其余病變均得到了恢復(fù),這表明這些變化是一種可逆性反應(yīng),但這些病理學(xué)變化在OsrHSA和pHSA二者之間沒有顯著差異,表明OsrHSA與pHSA具有相似的毒性反應(yīng),說明OsrHSA是安全。為了在植物細(xì)胞中獲得人源化的糖苷修飾,我們采用TALEN技術(shù)對(duì)水稻胚乳細(xì)胞編碼糖苷修飾的酶進(jìn)行遺傳改造,總共構(gòu)建了 9個(gè)靶向OsFUT的TALEN載體和11個(gè)靶向OsXylT基因TALEN載體,進(jìn)行了水稻轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化。我們先鑒定hpt的陽性轉(zhuǎn)化植株,在此基礎(chǔ)上,從hpt陽性植物中進(jìn)一步篩選鑒定出GalT或FUT8陽性轉(zhuǎn)基因植株,最終從67個(gè)hpt陽性轉(zhuǎn)基因植株中獲得了10個(gè)FUT8陽性轉(zhuǎn)基因植株,從207個(gè)hpt陽性轉(zhuǎn)基因植株中獲得了46個(gè)GaIT陽性轉(zhuǎn)基因植株;使用特定引物進(jìn)一步鑒定目標(biāo)基因是否通過NHEJ機(jī)制整合到由TALENs創(chuàng)建的DSB中,不幸的是,結(jié)果沒有發(fā)現(xiàn)人類GalT或FUT8的插入到TALEN的靶標(biāo)位點(diǎn),顯示設(shè)計(jì)的TALEN可能沒有產(chǎn)生DSB。結(jié)果表明獲得的GalT或FUT8的轉(zhuǎn)基因植株均是通過隨機(jī)方式整合到水稻基因組。隨后,我們采用蛋白質(zhì)印跡法對(duì)GalT或FUT8的陽性轉(zhuǎn)基因株系的的表達(dá)進(jìn)行了檢測,檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn):從10個(gè)FUT8陽性轉(zhuǎn)基因品系檢測到了3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系的胚乳中表達(dá)了FUT8,從46個(gè)GalT陽性轉(zhuǎn)基因株系的胚乳中中檢測到GalT的表達(dá)。進(jìn)一步確定在表達(dá)FUT8和GalT蛋白的種子蛋白是否發(fā)生了N-糖基化結(jié)構(gòu)改變,以TP309作為對(duì)照,采用MALDI-TOF質(zhì)譜技術(shù)對(duì)陽性株系的糖苷結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示所有表達(dá)FUT8的轉(zhuǎn)基因品系種子均顯示出不同的植物特異性N-糖苷結(jié)構(gòu);在過表達(dá)FUT8的轉(zhuǎn)基因品系FF1-141-6的種子中,植物類型的糖苷結(jié)構(gòu)較TP309顯著降低了5%,只含木糖殘基/無巖藻糖的N-糖苷如GnMX,MMX和GnGnX的總量顯著降低,植物特異性糖苷的減少可能是由于哺乳動(dòng)物特異性FUT8編碼的基因表達(dá)所致。值得注意的是,在過表達(dá)GalT的轉(zhuǎn)基因系胚乳中的植物類型N-糖苷的顯著減少。可能是在胚乳中過表達(dá)人GalT基因,其機(jī)理可能是作用于GlcNAcMan5GlcNAc2的中心結(jié)構(gòu)域并抑制植物類型N-糖苷的形成。我們發(fā)現(xiàn)在XG4-133-1和XG2-118-9轉(zhuǎn)基因品系胚乳中缺少一種或兩種植物特異性N-糖苷結(jié)構(gòu)。在這個(gè)品系除了顯著減少的植物類型N-糖苷結(jié)構(gòu)之外,還檢測到了人源特異性的半乳糖基化和唾液酸化的N-糖苷結(jié)構(gòu)。在XG2-118-9轉(zhuǎn)基因系中,在81%哺乳動(dòng)物N-糖苷的26.44%糖苷被唾液酸化,這是首次在水稻胚乳細(xì)胞表達(dá)GalT基因產(chǎn)生了唾液酸化的糖苷結(jié)構(gòu)。由于半乳糖基化結(jié)構(gòu)作為唾液酸化的受體底物,早期研究報(bào)道在玉米、小麥和大麥等谷物作物物缺乏唾液酸化合成途徑的相關(guān)基因,在植物中實(shí)現(xiàn)唾液酸化的N-糖苷較為困難。另一方面,已有報(bào)道在水稻基因組存在編碼類似唾液酸轉(zhuǎn)移酶的基因,在我們結(jié)果中,在轉(zhuǎn)基因水稻中過量表達(dá)GalT,獲得了具有唾液酸糖苷結(jié)構(gòu)的N-糖苷,說明在水稻中較其他谷物作物具有更大的優(yōu)勢。由于糖基化藥物的唾液酸化影響其循環(huán)半衰期和生物活性,在植物生物藥物中的唾液酸與否是植物生物反應(yīng)器與動(dòng)物反應(yīng)器的最重要差別。我們的結(jié)果提供了人源化糖苷修飾可在水稻胚乳細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)的證據(jù),也再次證明水稻基因組的唾液酸轉(zhuǎn)移酶可以通過表達(dá)供唾液酸化的底物半乳糖來實(shí)現(xiàn)植物細(xì)胞的人源化糖苷修飾。綜上所述,我們結(jié)果表明OsrHSA中的殘留HCP的免疫原性較低,OsrHSA的安全性與血漿來源HSA相同。我們還證實(shí)了OsrHSA中的殘留HCP對(duì)人體是安全的假說,再次證明水稻胚乳細(xì)胞是最適合的分子醫(yī)藥宿主之一。此外,在水稻胚乳細(xì)胞過表達(dá)人半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶(GalT)可以為唾液酸化提供半乳糖苷底物,并獲得人特異的唾液酸糖苷結(jié)構(gòu)和同時(shí)降低β-1,2-木糖含量。這些結(jié)果證明了 OsrHSA的HCP具有較低的免疫原性和免疫毒性,植物類型N-糖苷可以通過基因工程技術(shù)獲得人源化的糖苷結(jié)構(gòu)。
【學(xué)位授予單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R91
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本文編號(hào)：2624308