【摘要】：纖溶酶原激活物抑制劑 1(Plasminogen activator inhoibitor-1,PAI-1)是纖溶系統(tǒng)的一個重要的負(fù)控調(diào)節(jié)因子。PAI-1能夠快速的抑制尿激酶型纖溶酶原激活劑(urokinase-typeplasiminogen activator,uPA)和組織型纖溶酶原激活劑(tissue-type plasiminogen activator,tPA)的活性來抑制纖維蛋白溶解過程。PAI-1表達量升高與心腦血管等疾病的發(fā)生密切相關(guān),研究表明通過抑制體內(nèi)PAI-1活性已成為血栓栓塞性疾病治療的新策略。因此,開發(fā)新型PAI-1抑制劑己成為本領(lǐng)域研究的熱點。本論文包括二個部分;在本論文第一部分中,基于之前設(shè)計的蛋白類PAI-1抑制劑(PAItrap),為了延長其半衰期,我們將PAItrap與人血清白蛋白(human serum albumin,HSA)融合形成一種新型長效性PAI-1抑制劑。但是,融合蛋白PAItrap-HSA對PAI-1的親和力下降了 3倍與PAItrap相比(33nM～10nM)。因此,我們采用理論計算方法進一步優(yōu)化PAItrap的抑制能力。經(jīng)過實驗篩選獲得一個高親和力突變體,命名為PAItrap(H37R)-HSA,相對于 PAItrap-HSA 抑制能力提高了 6 倍(5nM～33nM),相對于PAItrap半衰期延長200倍。我們采用血塊溶解實驗,證明了 PAItrap(H37R)-HSA能夠通過抑制內(nèi)源性或者外源性PAI-1促進血栓的溶解。為了能夠適用于小鼠模型研究,我們檢測了PAItrap(H37R)-HSA 對鼠源 PAI-1 的抑制能力(IC50=12nM)。在激光損傷誘導(dǎo)血栓形成小鼠模型中,我們觀察到PAItrap(H37R)-HSA有效阻礙了血栓的形成和血小板的聚集。并且在小鼠尾部出血實驗中,發(fā)現(xiàn)PAItrap(H37R)-HSA沒有影響小鼠全身性的凝血功能。這些結(jié)果表明,PAItrap(H37R)-HSA是一個安全有效的PAI-1抑制劑,能夠抑制血栓的形成或者加速內(nèi)源性血栓溶解。在本論文第二部分中,基于PAI-1·tPA米氏復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu),結(jié)合PAItrap設(shè)計的原理,我們將tPA的非活性絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域改造成一種全新的蛋白類PAI-1抑制劑,它通過與PAI-1結(jié)合形成穩(wěn)定的米氏復(fù)合物而阻止PAI-1對活性u/tPA的抑制作用。為了改善其藥代動力學(xué)效果,將其與HSA融合來延長其半衰期,此抑制劑被命名為PAItrap2-HSA。采用化學(xué)發(fā)光實驗,證明了 PAItrap2-HSA對PAI-1的抑制能力和特異性(IC50=260nM)。在體外實驗中,PAItrap2-HSA顯著性提高了血栓溶解能力通過抑制內(nèi)源性或者外源性PAI-1。在小鼠實驗中,PAItrap2-HSA能夠有效的抑制血栓的形成和血小板的聚集。在小鼠炎癥模型中,我們觀察到PAItrap2-HSA作為一個特異性的PAI-1抑制劑能夠顯著性降低血漿中炎癥因子和PAI-1的含量,提高了小鼠的生存率。同時,也沒有觀察到PAItrap2-HSA引起小鼠的出血風(fēng)險。這些實驗結(jié)果表明,PAItrap2-HSA能夠通過調(diào)節(jié)PAI-1的活性和PAI-1的含量,為治療血栓性疾病和炎癥提供了一種新的治療思路。
【圖文】：

ｃｅｎｔｒｅ邋ｌｏｏｐ，邋ＲＣＬ）組成。ＰＡＩ－１存在三種不同構(gòu)象：激活態(tài)、潛伏態(tài)（ｌａｔｅｎｔ邋ｆｏｒｍ，逡逑其ＲＣＬ自發(fā)插入自身的Ｐ－ｓｈｅｅｔ邋Ａ中導(dǎo)致其活性喪失）以及剪切態(tài)（ｃｌｅａｖｅｄ邋ｆｏｒｍ，逡逑其ＲＣＬ被ＰＡ切段并插入自身的Ｐ－ｓｈｅｅｔＡ中）（如圖１－１）邋［１２］。其中ＲＣＬ是ＰＡＩ－逡逑１發(fā)揮抑制活性的主要部位，它能插入到其靶酶纖溶酶原激活物（ＰＡ）的催化中逡逑心并與其共價結(jié)合，導(dǎo)致靶酶催化中心構(gòu)象變形而失活。ＰＡＩ－１對ｔＰＡ或者ｕＰＡ逡逑的抑制非常的快，其抑制二級速率常數(shù)是而對于凝血酶，纖溶酶，激逡逑活蛋白Ｃ具有非常低的親和力（ｌ0Ｍ0４邋Ｍ＇Ｖ１）逡逑ｉｆｆ逡逑Ａ？激活態(tài)（ＰＤＢ邋１ＤＶＭ）邋Ｂ．潛伏態(tài)（ＰＤＢ邋１ＤＶＮ）邋Ｃ．剪切態(tài)｛ＰＤＢ邋３ＣＶＭ｝逡逑圖１－１．邋ＰＡＩ－１的三種構(gòu)象。０－ｓｈｅｅｔＡ標(biāo)記為紅色，ＲＣＬ為黃色。逡逑另外，我們課題組在２０１１年和２０１５年測定了邋ｕＰＡ＿ＰＡＩ－ｌ米氏復(fù)合物和逡逑ｔＰＡ．ＰＡＩ－１米氏復(fù)合物三維晶體結(jié)構(gòu)（如圖１－２）［１６，，１７］。闡明了邋ＰＡＩ－１與纖溶酶原激逡逑活物的相互作用的機理。逡逑２逡逑

ｃｅｎｔｒｅ邋ｌｏｏｐ，邋ＲＣＬ）組成。ＰＡＩ－１存在三種不同構(gòu)象：激活態(tài)、潛伏態(tài)（ｌａｔｅｎｔ邋ｆｏｒｍ，逡逑其ＲＣＬ自發(fā)插入自身的Ｐ－ｓｈｅｅｔ邋Ａ中導(dǎo)致其活性喪失）以及剪切態(tài)（ｃｌｅａｖｅｄ邋ｆｏｒｍ，逡逑其ＲＣＬ被ＰＡ切段并插入自身的Ｐ－ｓｈｅｅｔＡ中）（如圖１－１）邋［１２］。其中ＲＣＬ是ＰＡＩ－逡逑１發(fā)揮抑制活性的主要部位，它能插入到其靶酶纖溶酶原激活物（ＰＡ）的催化中逡逑心并與其共價結(jié)合，導(dǎo)致靶酶催化中心構(gòu)象變形而失活。ＰＡＩ－１對ｔＰＡ或者ｕＰＡ逡逑的抑制非常的快，其抑制二級速率常數(shù)是而對于凝血酶，纖溶酶，激逡逑活蛋白Ｃ具有非常低的親和力（ｌ0Ｍ0４邋Ｍ＇Ｖ１）逡逑ｉｆｆ逡逑Ａ？激活態(tài)（ＰＤＢ邋１ＤＶＭ）邋Ｂ．潛伏態(tài)（ＰＤＢ邋１ＤＶＮ）邋Ｃ．剪切態(tài)｛ＰＤＢ邋３ＣＶＭ｝逡逑圖１－１．邋ＰＡＩ－１的三種構(gòu)象。０－ｓｈｅｅｔＡ標(biāo)記為紅色，ＲＣＬ為黃色。逡逑另外，我們課題組在２０１１年和２０１５年測定了邋ｕＰＡ＿ＰＡＩ－ｌ米氏復(fù)合物和逡逑ｔＰＡ．ＰＡＩ－１米氏復(fù)合物三維晶體結(jié)構(gòu)（如圖１－２）［１６，１７］。闡明了邋ＰＡＩ－１與纖溶酶原激逡逑活物的相互作用的機理。逡逑２逡逑
【學(xué)位授予單位】：福建農(nóng)林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R914;R966

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本文編號：2619545