【摘要】：植物內(nèi)生真菌與宿主之間長期互生共存,使得它們之間的關(guān)系變得十分復(fù)雜。同時,內(nèi)生真菌可以產(chǎn)生大量的次級代謝產(chǎn)物,具有抗腫瘤、抗菌、抗病毒等活性,因此,植物內(nèi)生菌作為天然藥物的資源寶庫值得不斷探索。本論文以一株分離自健康三七根部的青霉屬真菌Penicillium janthinellum SYPF 7899為研究對象,綜合運用硅膠柱色譜、ODS柱色譜、Sephadex LH-20柱色譜、反相半制備HPLC等色譜學(xué)分離手段對其固體發(fā)酵產(chǎn)物中的次級代謝物進行了研究,共得到32個單體化合物。根據(jù)理化性質(zhì)、波譜數(shù)據(jù)(UV、IR、MS、1H-NMR、13C-NMR 和 2D-NMR)、計算 ECD、化學(xué)衍生化(Mosher)等方法鑒定化合物的平面結(jié)構(gòu)及立體結(jié)構(gòu),分別為:brefeldin El(1),brefeldin E2(2),brefeldin E3(3),brefeldin E4(4),brefeldin E5(5),brefeldin A(6),brefeldin A 7-0-acetate(7),altemariol-5-O-methyl ether(8),3'-hydroxyalternariol-5-O-methyl ether(9),mangrovamides A(10),brasiliamide J-a(11),brasiliamide J-b(12),peniciolidone(13),dehydroaustinol(14),dehydroaustin(15),7-hydroxydehydroaustin(16),1,2-dihydro-acetoxydehydroaustin(17),austinol(18),austin(19),5R-isoaustinone(20),l1β-acetoxyisoaustinone(21),4-toluene-1,3-dicarbamic acid dimethyl ester(22),glicoricone(23),striatisporolide A-l1-formylation(24),4-hydroxy-benzaldehyde(25),orcinol(26),penicillic acid-a(27),furanone glucoside(28),penicillic acid-b(29),5-hydroxy-3-isopropyl-4-methoxyfuranone(30),(2S,3R)-2,3-epoxyhexanoic acid(31),methyl 2-(2-acetyl-3-hydroxy-5-methoxyphenyl)acetate(32)。其中1-5,11-13為新化合物,其余為已知化合物。對分離到的所有化合物進行活性研究,發(fā)現(xiàn)部分化合物具有較強抗菌、抗腫瘤和抗病毒活性。其中化合物6-7對六株人類致病菌,包括蠟樣芽胞桿菌(Bacillus cereus)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、大腸埃希氏菌(Escherichia olli)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)具有較強的抑制作用�；衔�6的最小抑菌濃度(MIC)分別為20、25、22、35、36和28μg/mL;化合物7的MIC分別為21、28、22、38、39和31 μg/mL;化合物11-12對革蘭氏陽性細菌B.cereus、B.subtilis和S.aureus有明顯的抑菌效果,化合物11的MIC分別為25、18和18 μg/mL;化合物12的MIC分別為21、15和18μg/mL。通過觀察菌體形態(tài),發(fā)現(xiàn)化合物11和12作用后的B.subtilis菌體變長而不分裂、S.aureus菌體腫脹變大而不分裂。采用分子對接研究發(fā)現(xiàn),化合物11和12能分別與負責(zé)細菌分裂的絲狀溫度敏感蛋白(filamentous temperature-sensitive protein Z,FtsZ)很好結(jié)合,且能量值均低于蛋白本身的共結(jié)晶小分子(ligand),表明化合物11和12很可能是通過與FtsZ蛋白結(jié)合導(dǎo)致細菌分裂受阻,最終細菌死亡。另一方面,化合物6和7亦顯示出對腫瘤細胞HepG2,Huh7,KB和MDA-MB-231較強的細胞毒作用,其抑制活性(ID50)分別為分別為0.024、0.028、0.0625和0.064 μM及0.024、0.035、0.06和0.064μM,與陽性對照藥物L(fēng)-脫氧胞苷(LODDC)相似。以HepG2為研究對象,發(fā)現(xiàn)其抗腫瘤作用是通過抑制細胞分裂間期的S期,從而導(dǎo)致細胞生長受阻。此外,化合物6和7對丙型肝炎病毒(HCV)亦顯示出較強的抑制活性,其ID50分別為0.022和0.013μM。內(nèi)生真菌Pjanthinellum SYPF 7899及其代謝物對常見的三七致病菌Alternaria brassicicola、Cylindrocapon destructans和Fusarium solani有不同程度的抑制活性,其中化合物6和7的抑制作用較強(MIC30 μg/mL)。以菌株SYPF 7899制備的生物菌劑施用于云南三七大田后,發(fā)現(xiàn)其能顯著降低根腐病發(fā)病率;提高植株的高度、莖鮮重、根鮮重、根干重;顯著提高根尖防御酶(過氧化物酶,POD;超氧化物歧化酶,SOD;過氧化氫酶,CAT)的活性;提高三七根部皂苷含量;而且對三七根尖細胞無損害,充分顯示其促生作用。使用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法成功獲得增強綠色螢光蛋白(Enhance Green Fluorescent Protein EGFP)基因標記的轉(zhuǎn)化菌株SYPF 7899-egfp,并將該菌株回植到三七植株根際周圍,定期追蹤,發(fā)現(xiàn)其能成功定殖和存活在三七根際土中,證明P.janthinellum SYPF 7899對三七的益生作用與菌體定殖和繁殖、保護植物健康生長、促進藥效物質(zhì)產(chǎn)生有緊密關(guān)系,顯示其作為生防菌劑的潛在價值。
【學(xué)位授予單位】：沈陽藥科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R915
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本文編號：2618994