【摘要】：化學(xué)品使用日趨廣泛,傳統(tǒng)化學(xué)品毒性評價方法已無法滿足有害化學(xué)物質(zhì)暴露急劇增加及大量新化合物的評價需求。作為傳統(tǒng)實驗動物可替代的評價方法,體外活體細(xì)胞模型可以高靈敏地感知細(xì)胞外界環(huán)境的變化,并且通過多種細(xì)胞參數(shù)變化直接反映出來。故利用細(xì)胞在化學(xué)品、藥品、環(huán)境毒素等外界刺激下,相應(yīng)的代謝、阻抗等細(xì)胞生理參數(shù)的變化,可以間接監(jiān)測毒性大小。本論文以微流控技術(shù)和電化學(xué)生物傳感技術(shù)為基礎(chǔ),構(gòu)建了化學(xué)品間接毒性監(jiān)測平臺,可用于化學(xué)品暴露的高效毒性預(yù)警和評價,以及加快新藥研發(fā)過程中藥物毒副作用及機理的研究進程。主要工作如下:平臺理論及設(shè)計部分,重點介紹了化學(xué)品間接毒性監(jiān)測平臺中所涉及的細(xì)胞阻抗、細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞代謝、微流控系統(tǒng)等基本原理,確定了化學(xué)品間接毒性監(jiān)測平臺中兩個核心傳感芯片即生物反應(yīng)器和細(xì)胞代謝監(jiān)測芯片的結(jié)構(gòu),其中兩個芯片之間由微通道和外部管道連接,并用微注射泵系統(tǒng)控制。生物反應(yīng)器為可拆卸設(shè)計,能實現(xiàn)細(xì)胞培養(yǎng),保證快速、簡便、實時細(xì)胞阻抗監(jiān)測,同時方便重復(fù)使用過程中芯片的清洗等操作。該反應(yīng)器由透明或半透明材料制成,方便光學(xué)顯微鏡對細(xì)胞的生長狀態(tài)的觀察。細(xì)胞代謝監(jiān)測芯片,為三明治可拆卸結(jié)構(gòu),其中檢測電極為葡萄糖氧化酶和乳酸氧化酶修飾的絲網(wǎng)印刷電極,用于細(xì)胞外環(huán)境中葡萄糖和乳酸同時在線含量檢測。平臺制作及測試部分,基于以上設(shè)計方案,采用計算機輔助設(shè)計(Computer-aided design,CAD)制圖軟件設(shè)計芯片,使用濺射、光刻、計算機數(shù)字控制(Computer numerical control,CNC)等微加工工藝對其進行制作,并對所制備的芯片進行形貌和性能的考察。生物反應(yīng)器主要包括:聚二甲基硅氧烷(Polydimethylsiloxane,PDMS)細(xì)胞培養(yǎng)腔、叉指電極層和聚甲基丙烯酸甲酯(Polymethyl methacrylate,PMMA)夾具。叉指電極層中電極條完整,電極寬度為15μm和電極間距為30μm。細(xì)胞培養(yǎng)腔與叉指電極層進行生物相容性封裝,無死腔。細(xì)胞代謝監(jiān)測芯片包括:PMMA夾具、PDMS通道層和絲網(wǎng)印刷電極。所制備電極的葡萄糖檢測范圍為0~25 m M,乳酸檢測范圍為0~20 mM。樣品測量前通過微流控系統(tǒng)自動進行標(biāo)準(zhǔn)液校準(zhǔn)、空氣吹掃、PBS穩(wěn)定,整個循環(huán)為10 min�；瘜W(xué)品間接毒性監(jiān)測平臺細(xì)胞阻抗采樣間隔為10 s,細(xì)胞代謝監(jiān)測采樣間隔為10 min。實驗分析部分,基于所構(gòu)建的化學(xué)品間接毒性監(jiān)測平臺,考察了Hep G2細(xì)胞生長過程中的細(xì)胞阻抗,細(xì)胞代謝隨時間的變化。結(jié)合細(xì)胞阻抗和細(xì)胞代謝過程中葡萄糖攝取率和乳酸產(chǎn)生率三種參數(shù)評價了D-山梨醇、對乙酰氨基酚、環(huán)磷酰胺、胺碘酮和魚藤酮對HepG2細(xì)胞毒性,驗證了平臺間接評價化學(xué)品毒性可行性,并提出了相應(yīng)的風(fēng)險評估策略。此外,通過監(jiān)測多種細(xì)胞參數(shù),能更好地解釋和區(qū)分不同化學(xué)品對細(xì)胞作用的機理。本研究所構(gòu)建的間接毒性監(jiān)測平臺有望應(yīng)用于細(xì)胞代謝生理學(xué)、線粒體呼吸功能測定、細(xì)胞培養(yǎng)條件優(yōu)化等生物醫(yī)藥領(lǐng)域,為相關(guān)化學(xué)品和生態(tài)風(fēng)險評估體系的建立提供了方法依據(jù),在生命健康安全、生態(tài)文明建設(shè)等方面有著深遠(yuǎn)的意義。
【圖文】：

圖 1-1. 生物傳感器結(jié)構(gòu)示意圖Figure 1-1. Schematic diagram of biosensor structure1.3.1 電化學(xué)酶傳感器以酶作為分子識別元件的酶傳感器，是最早研發(fā)的一種生物傳感器，也是現(xiàn)在應(yīng)用最廣泛的商用傳感器[50]。將酶固定在電極表面，再通過酶的催化作用，與生物分子發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，在信號轉(zhuǎn)換器的作用下通過記錄酶促反應(yīng)產(chǎn)物的電化學(xué)變化，達到間接測定分析物的目的[51]。酶生物傳感器發(fā)展經(jīng)歷了三個重要的階：第一個階段是以氧為中繼體的電催化，通過測量反應(yīng)物O2的減少或反應(yīng)產(chǎn)物H2O2的產(chǎn)生量來實現(xiàn)分析物的測定；第二個階段是利用具有較低氧化電位的傳遞介體在電極上產(chǎn)生的氧化電流，能夠避免其他電活性物質(zhì)的干擾，提高測定的靈敏度和準(zhǔn)確性；第三階段是利用酶與電極之間的直接電子傳遞，選擇合適的交聯(lián)劑，將酶共價修飾到電極上，使酶氧化還原活性中心與電極接近，能夠相對容易地直接進行電子傳遞。本文后續(xù)細(xì)胞代謝的監(jiān)測中，采用電化學(xué)酶傳感器，故在本文的第二章對其原理進行了詳細(xì)的闡述。1.3.2 電化學(xué)免疫傳感器電化學(xué)免疫傳感器利用抗體對特定化合物或抗原具有特異親和力，通過結(jié)合后所產(chǎn)生的電信號變化對目標(biāo)檢測物進行定量[52]。電化學(xué)免疫傳具有操作簡單、快速、靈敏、

2.1.1 細(xì)胞阻抗傳感器細(xì)胞阻抗傳感器（Electric Cell-substrate Impedance Sensor, ECIS）是指體外環(huán)境下，通過對活體細(xì)胞的阻抗進行非侵入性監(jiān)測，從而對細(xì)胞粘附，擴散和運動進行分析，達到監(jiān)測細(xì)胞生理變化的目的[77, 78]。在生長和繁殖之前，細(xì)胞需要在培養(yǎng)基底或表面進行黏附，形成黏著斑（Focal adhesion）。圖 2-1 顯示了 Giaever 和 Keese 首次將平面電極通過測量阻抗來檢測細(xì)胞形態(tài)變化的原理[79, 80]。將微電極構(gòu)建在細(xì)胞附著平臺下方，在電極上施加交流，如果電極表面沒有細(xì)胞，電流可以在表面自由流動。然而當(dāng)細(xì)胞生長在電極表面后，細(xì)胞會將阻礙電流，增加系統(tǒng)的電阻。這是因為完整的細(xì)胞膜是高度絕緣的，而當(dāng)一些化學(xué)品或者藥物作用于細(xì)胞時，細(xì)胞與電極之間的黏附率會受到影響，或者細(xì)胞本身受到損傷，細(xì)胞膜完整性受到影響，這些都會導(dǎo)致系統(tǒng)的阻抗改變。在直流或是低頻交流時，電流更傾向于流經(jīng)細(xì)胞與電極之間的間隙，，以及細(xì)胞與細(xì)胞之間的間隙，因此低頻阻抗更能反映細(xì)胞與電極之間阻抗貼附的緊密程度，以及細(xì)胞之間的連接情況。在高頻交流情況下，電流開始穿透細(xì)胞膜，流經(jīng)細(xì)胞質(zhì)從而反映細(xì)胞膜完整性和細(xì)胞生理狀態(tài)信息[71]，并且這種施加信號是對細(xì)胞無損的，可以用于長時間細(xì)胞的監(jiān)測[81]。
【學(xué)位授予單位】：石河子大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：TP212;R99

【參考文獻】

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本文編號：2616102