【摘要】：本論文包含兩個(gè)章節(jié),第一章的內(nèi)容是谷草酰胺轉(zhuǎn)移酶(GOT1)天然產(chǎn)物抑制劑Aspulvinone O的發(fā)現(xiàn)過程及其活性評(píng)價(jià);第二章主要論述GOT1已成藥化合物抑制劑的篩選及其抗腫瘤活性的研究過程。第一章胰腺導(dǎo)管腺癌細(xì)胞(PDAC)依賴于非經(jīng)典并且獨(dú)特的谷氨酰胺代謝途徑,在該代謝通路中谷氨酰胺衍生的天冬氨酸通過谷草酰胺轉(zhuǎn)移酶1(GOT1)轉(zhuǎn)化為草酰乙酸后經(jīng)過系列催化,為細(xì)胞生長、代謝提供原料。同時(shí)GOT1在能量代謝和ROS平衡中也存在重要作用。研究表明人為降低PDAC細(xì)胞中GOT1表達(dá)量,抑制PDAC細(xì)胞增殖的同時(shí)對(duì)于正常組織細(xì)胞的生長并未影響。通過對(duì)實(shí)驗(yàn)室化合物庫進(jìn)行GOT1酶活性抑制作用的評(píng)估,選擇抑制效果較強(qiáng)的化合物Aspulvinone O(AO)作為抗腫瘤活性的研究對(duì)象。首先通過分子對(duì)接實(shí)驗(yàn)證明化合物AO通過與Trp141形成疏水鍵,與Thr110和Ser256形成氫鍵相互作用與GOT1形成特異性的結(jié)合。微量熱泳動(dòng)儀(MST)、藥物與靶標(biāo)親和力穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)(DARTS)在分子水平和細(xì)胞水平上進(jìn)一步證明了GOT1與化合物AO的緊密結(jié)合。GOT1基因在幾種PDAC細(xì)胞系中的沉默的相關(guān)實(shí)驗(yàn)檢測以及熱遷移實(shí)驗(yàn)(CETSA)充分驗(yàn)證了AO對(duì)于GOT1抑制的靶向性。另外,通過檢測GOT1參與的谷氨酰胺的代謝通路中其上下游代謝產(chǎn)物的表達(dá)水平表明化合物AO可通過抑制GOT1,進(jìn)而封鎖該條代謝通路。更重要的是在體內(nèi)活性評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)中,化合物AO顯著抑制SW1990細(xì)胞在CB17/SCID小鼠模型中的增殖。綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)了一種GOT1抑制劑——化合物AO,可作為新型的胰腺導(dǎo)管癌抑制劑。第二章腫瘤細(xì)胞的主要特征之一是通過轉(zhuǎn)變代謝途徑滿足腫瘤微環(huán)境改變所需要的營養(yǎng)。越來越多的研究結(jié)果表明,除依賴糖酵解提供營養(yǎng)外,部分腫瘤細(xì)胞對(duì)于谷氨酰胺代謝展現(xiàn)出極大的成癮性。鑒于前期基于該代謝通路中GOT1抑制劑的研究,為節(jié)約藥物開發(fā)成本,縮短藥物進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn)的時(shí)間,在本階段實(shí)驗(yàn)中,根據(jù)前期建立的酶活性篩選體系,針對(duì)實(shí)驗(yàn)室建立的已成藥化合物庫進(jìn)行GOT1活性抑制作用的檢測,篩選結(jié)果顯示得到兩個(gè)已成藥化合物鹽酸齊拉西酮與阿達(dá)帕林對(duì)GOT1酶活性具有明顯的抑制作用,其在臨床上分別用于精神病和皮膚痤瘡的治療。在后續(xù)研究中,首先通過MTT檢測其對(duì)于實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有腫瘤細(xì)胞系的抑制作用,確定了其對(duì)SW1990細(xì)胞和ES-2細(xì)胞的顯著抑制效果并將這兩種細(xì)胞作為后續(xù)的研究重點(diǎn)。隨后通過MST和DARTs實(shí)驗(yàn)證明化合物與GOT1蛋白之間的體外結(jié)合力。同時(shí)EdU增殖實(shí)驗(yàn)、Hoechst33258染色實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell遷移實(shí)驗(yàn)都進(jìn)一步表明兩個(gè)化合物在體外誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和抑制腫瘤細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)移作用。更重要的是CB17/SCID小鼠荷瘤實(shí)驗(yàn)證明鹽酸齊拉西酮在體內(nèi)水平上抑制腫瘤細(xì)胞生長,其肝臟的免疫組化實(shí)驗(yàn)更加充分驗(yàn)證鹽齊拉西酮可抑制SW1990細(xì)胞的體內(nèi)轉(zhuǎn)移。綜上所述,我們通過實(shí)驗(yàn)分別在體內(nèi)和體外證明兩個(gè)已成藥化合物對(duì)于腫瘤細(xì)胞的抑制,這種“老藥新用”的研究方式對(duì)于腫瘤細(xì)胞的抑制劑的發(fā)現(xiàn)具有有很大意義。
【圖文】：

華 中 科 技 大 學(xué) 碩 士 學(xué) 位 論 文藍(lán) Biosharp硫酸鈉 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司醇 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司Biosharp國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司e 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司載體質(zhì)粒是 pET28a，，如圖所示

圖 2-1 GOT1-homo 與 GOT1-mouse 蛋白小量檢測結(jié)果Lane M 為蛋白 Maker；Lane 1、3、5、7 分別為破碎離心后上清；Lane 2、 4、 6、 8 分別為 Ni 提取后樣本；Lane 1、2、7、8 為導(dǎo)入 BL21 star 感受態(tài)；Lane 3、4 、5、6 導(dǎo)入PlysS 感受態(tài)；Lane 1、2、3、4 為 GOT1-homo 蛋白；Lane 5、6、7、8 為 GOT1-mouse 蛋白。7255433426Lane M 1 2 3 4 5 6 7 8
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R96

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本文編號(hào)：2592878