【摘要】：建立了親水相互作用-液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析糖胺聚糖類復(fù)雜樣品的方法。在高分辨質(zhì)譜聯(lián)用條件下,流動(dòng)相5 mmol/L醋酸銨緩沖溶液可有效使用。在此基礎(chǔ)上,對(duì)不同的色譜柱進(jìn)行了篩選。其中,氨基親水相互作用色譜柱對(duì)糖胺聚糖類寡糖的分離效果不佳;酰胺基親水相互作用色譜柱僅適用于透明質(zhì)酸寡糖的分析,可以有效分離聚合度2~20的透明質(zhì)酸寡糖;在較高溫度下,兩性離子基質(zhì)的親水相互作用色譜柱可以對(duì)聚合度2~30的透明質(zhì)酸寡糖和聚合度2~12的硫酸軟骨素寡糖有效分離;而二醇基親水相互作用色譜柱對(duì)透明質(zhì)酸(聚合度2~30)、硫酸軟骨素(聚合度2~20)以及肝素(聚合度4~20)都適用,并呈現(xiàn)出較好的分離效果。本研究比較了不同類型的親水相互作用色譜結(jié)合高分辨質(zhì)譜對(duì)不同聚合度、不同電荷密度的糖胺聚糖寡糖的分離特點(diǎn),建立了相應(yīng)的高效分離和分析方法。本方法有較高的分辨率和質(zhì)譜適用性。
【圖文】：

15］中，氨基-HILIC色譜柱已被用于糖胺聚糖二糖分析［15］，但該法以高濃度不揮發(fā)性緩沖鹽作為流動(dòng)相，因此無(wú)法與質(zhì)譜聯(lián)用，而且對(duì)于寡糖的分離和分析并沒有直接的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)使用氨基-HILIC色譜柱進(jìn)行糖胺聚糖的寡糖分析，結(jié)果表明，即使在高濃度醋酸銨緩沖鹽的條件下，寡聚糖仍然無(wú)法被完全洗脫(譜圖未顯示)，而據(jù)經(jīng)驗(yàn)100mmol/L以上的揮發(fā)性鹽已經(jīng)對(duì)質(zhì)譜檢測(cè)造成了影響。302018t（min）A232（mAU）100-10-20-3020222426dp16dp14dp12dp10dp8dp6dp4dp2dp18dp202830圖1酰胺基-親水相互作用色譜柱30℃條件下所得透明質(zhì)酸分離譜圖Fig．1Chromatogramsofhyaluronicacid(HA)obtainedonamide-hydrophilicinteractionliquidchromatography(HILIC)column造成這種現(xiàn)象可能是該氨基柱中樹脂表面鍵合的氨基基團(tuán)與糖胺聚糖寡糖結(jié)合作用太強(qiáng)，，而揮發(fā)性鹽的離子強(qiáng)度太弱，無(wú)法對(duì)寡糖進(jìn)行洗脫，因此不能進(jìn)行HPLC-MS分析。3．2酰胺基-HILIC色譜柱對(duì)糖胺聚糖類寡糖的分離采用酰胺基-HILIC色譜柱分別對(duì)HA、CS-A和HP進(jìn)行分析，結(jié)果表明，HA寡聚糖能夠得到很好的分離，如圖1所示。根據(jù)相應(yīng)質(zhì)譜結(jié)果(圖譜未顯示)，色譜圖中每個(gè)峰得到了準(zhǔn)確的歸屬。其中HA寡聚糖在聚合度2～20的范圍內(nèi)能夠得到很好的分離。然而在使用此色譜柱對(duì)CS-A與HP寡糖混合物進(jìn)行分離時(shí)，在合理的緩沖鹽濃度范圍內(nèi)無(wú)法有效洗脫寡糖(譜圖未顯示)。該色譜柱樹脂表面的酰胺基團(tuán)具有較弱的離子作用，能夠與含有較少負(fù)電荷的HA的寡聚糖產(chǎn)生適當(dāng)?shù)南嗷プ饔茫⒛軌蛴行Х蛛xHA寡糖。3．3兩性離子(ZIC)-HILIC色譜柱對(duì)糖胺聚糖類寡糖的分析本實(shí)驗(yàn)使用ZIC-HILIC色譜柱分別對(duì)3種糖胺聚糖類寡糖進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，HA寡糖在聚合度

失，同時(shí)還保留了較高的分辨率(圖2B)。此外，此色譜柱也對(duì)CS-A具有較好的分辨率(圖2C)。但此色譜柱不適用于HP的分離分析。3020100-10500-50-100-1505-5-15-25-352.55.07.510.012.515.017.520.022.525.025.5t(min)2.55.07.510.012.515.017.520.022.525.025.5t(min)2.55.07.510.012.515.017.520.022.525.025.5t(min)ABCdp2dp4dp6dp8dp10dp12dp14dp16dp18dp20dp24dp30dp26dp28dp2dp4dp6dp8dp10dp12dp14dp16dp18dp20dp22dp24dp2dp4dp8dp10dp12dp22dp6A232(mAU)A232(mAU)A232(mAU)圖2兩性離子-HILIC色譜柱所得HA/硫酸軟骨素A寡聚糖分離譜圖。(A)色譜柱30℃條件下所得HA寡聚糖分離譜圖(B)色譜柱85℃條件下所得HA寡聚糖分離譜圖(C)色譜柱85℃條件下所得CS-A寡聚糖分離譜圖Fig．2HA/chondroitinsulfateA(CS-A)oligosaccharidesobtainedonthezwitterionic(ZIC)-HILICcolumn．(A)ChromatogramofHAoligosaccharidesobtainedonZIC-HILICcolumnat30℃;(B)ZIC-HILICcolumnat85℃;and(C)ZIC-HILICcolumnat85℃3．4二醇基(Diol)-HILIC色譜柱對(duì)糖胺聚糖類寡糖的分離使用Diol-HILIC色譜柱分別對(duì)3種寡聚糖進(jìn)行了分離。結(jié)果表明，HA寡糖在聚合度2～30范圍內(nèi)能夠得到有效分離(圖3A);CS-A寡糖在聚合度2～20范圍內(nèi)達(dá)到較好分離(圖3B);HP寡糖在聚合度4～20范圍內(nèi)也得到了較高分辨率的分離(圖3C)。質(zhì)譜數(shù)據(jù)確定了每個(gè)相應(yīng)色譜峰的聚合度(圖譜未顯示)。在圖3可見，只有HA寡聚糖中一些低聚合度的寡糖出現(xiàn)了α-、β-共存導(dǎo)致的分岔現(xiàn)象。此類型色譜柱樹脂表面二醇基的弱電離作用使得具有不同分子大小和不同電荷密度的這類聚?

【共引文獻(xiàn)】

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1 李媛媛;韋Z赯

本文編號(hào)：2568825