發(fā)布時間：2019-11-12 12:00

【摘要】：目的:RNA干擾(RNA interference,RNAi)的發(fā)現(xiàn),被認為是生物學中最重要的發(fā)現(xiàn)之一。許多類型的疾病,包括病毒感染、癌癥等已被證實可作為RNAi治療的潛在目標。在近十幾年來,RNAi在基因功能和基因治療方面的研究越來越受到人們的關注,逐漸發(fā)展成為一種較為成熟的技術。但是,裸露siRNA穩(wěn)定性差,易被體內(nèi)的核酸酶降解,且自身的性質,如分子量高、負電性、親水性等阻礙了其跨膜轉運,極大地限制了siRNA的進一步應用。因此如何高效地運輸siRNA至靶細胞并有效的穿過細胞膜釋放到細胞質中成為人們研究的熱點。細胞穿膜肽是由5-30個氨基酸組成的陽性或兩性的短肽,具有轉染活性高,生物活性好,低毒性等優(yōu)點,而且其自身不僅能夠高效的穿過細胞膜進入細胞,也可以介導其他外源性的分子進入細胞,是目前快速發(fā)展的一種新型藥物載體。最近,細胞穿膜肽用于siRNA的細胞遞送已經(jīng)逐漸成為人們研究的熱點。但是作為siRNA的運輸載體,細胞穿膜肽的攝取效率低,且不易從內(nèi)涵體內(nèi)逃出,極大地限制了細胞穿膜肽的應用。因此,為了提高siRNA攝取效率,需要對細胞穿膜肽進行修飾,使其能與siRNA更好地復合,使制劑更穩(wěn)定,攝取效率大大提高。本文構建了寡聚精氨酸(R8)與siRNA的納米復合物,經(jīng)過硬脂酰化和聚乙二醇化分別合成了STR-R8和STR-R8-PEG兩種不同的載體材料,制備了STR-R8/siRNA、STR-R8-PEG/siRNA和STR-R8-PEGn/siRNA三種不同的納米復合物。通過粒徑、電位、電泳行為等評價不同處方的納米復合物,篩選出理化性質優(yōu)良的處方。并以MCF-7、HT-1080和Hela細胞為模型,考察載體與細胞之間相互作用。方法:通過查閱文獻及試驗,確定了壓縮材料STR-R8和STR-R8-PEG的合成和純化方法。在室溫條件下,將SA-NHS與CPP攪拌反應30 min,純凈水透析24 h,冷凍干燥后的產(chǎn)物即為STR-R8。在室溫條件下,將STR-R8與m PEG2000-Mal避光反應24 h,純凈水透析24 h,冷凍干燥后的產(chǎn)物即為STR-R8-PEG。通過MS對該合成產(chǎn)物進行表征。通過參考文獻和大量預試驗,以siRNA為模型藥物,篩選納米復合物的處方。以制劑的粒徑、電位和瓊脂糖凝膠的電泳行為等為指標,考察制劑的理化性質,篩選出最佳的制劑處方。以MCF-7、HT-1080和Hela為細胞模型,通過流式細胞儀定量分析評價細胞攝取率,通過倒置熒光顯微鏡觀察納米復合物在細胞中的分布以及定位。結果:通過質譜結果分析,合成得到了STR-R8和STR-R8-PEG。此方法條件溫和,方法簡單快捷。通過純化能夠得到純度較高的產(chǎn)物。以siRNA為模型藥物,通過室溫孵育的方法,能夠簡單快捷的制備siRNA納米復合物。以粒徑、電位和凝膠電泳行為為指標,得出STR-R8處方的粒徑在200 nm以內(nèi),Pd I比較均勻,N/P值大于等于20時,能夠很好的包裹siRNA;STR-R8-PEG處方粒徑在300 nm左右,Pd I均勻,N/P值等于20時,仍不能將siRNA完全包裹;因此考慮將STR-R8和STR-R8-PEG兩種載體材料按一定比例混合,制備復合載體材料STR-R8-PEGn。經(jīng)過大量試驗最終篩選出的最佳處方為N/P比均為20的STR-R8/siRNA和STR-R8-PEG20%/siRNA。通過流式細胞儀的結果可知:在MCF-7和HT-1080兩種細胞中,與游離siRNA相比,STR-R8和STR-R8-PEG20%均能夠大大地提高siRNA的細胞攝取率。且兩種載體作用于MCF-7細胞后,其細胞攝取率均能夠達到市售試劑的水平。對于HT-1080細胞,細胞攝取率呈現(xiàn)時間依賴性,即給藥時間越長,細胞攝取率越大。但對于MCF-7細胞,在給藥2 h后,細胞攝取率達到最大,之后隨著時間的推移,細胞攝取率逐漸降低。通過倒置熒光顯微鏡可知:STR-R8和STR-R8-PEG20%均能夠很好地介導siRNA進入細胞,并將siRNA定位在細胞質中。結論:STR-R8和STR-R8-PEG合成方法簡單快捷,條件溫和,產(chǎn)物中雜質較少,為接下來的試驗奠定了基礎。經(jīng)過大量試驗篩選的處方STR-R8/siRNA和STR-R8-PEG20%/siRNA粒徑符合要求,且分布均勻,能夠完全包載siRNA。通過流式細胞儀和倒置熒光顯微鏡的結果可得STR-R8和STR-R8-PEG20%兩種載體材料能大大提高siRNA的攝取效率并且實現(xiàn)siRNA的細胞質釋放。
【圖文】：

STR-R8純化前質譜結果

圖 1-2 STR-R8 純化后質譜結果Fig.1-2 Characterization of STR-R8 after dialysis in purified water with MS(m/z)
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R914

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本文編號：2559760