【摘要】：目的:RNA干擾(RNA interference,RNAi)的發(fā)現(xiàn),被認(rèn)為是生物學(xué)中最重要的發(fā)現(xiàn)之一。許多類(lèi)型的疾病,包括病毒感染、癌癥等已被證實(shí)可作為RNAi治療的潛在目標(biāo)。在近十幾年來(lái),RNAi在基因功能和基因治療方面的研究越來(lái)越受到人們的關(guān)注,逐漸發(fā)展成為一種較為成熟的技術(shù)。但是,裸露siRNA穩(wěn)定性差,易被體內(nèi)的核酸酶降解,且自身的性質(zhì),如分子量高、負(fù)電性、親水性等阻礙了其跨膜轉(zhuǎn)運(yùn),極大地限制了siRNA的進(jìn)一步應(yīng)用。因此如何高效地運(yùn)輸siRNA至靶細(xì)胞并有效的穿過(guò)細(xì)胞膜釋放到細(xì)胞質(zhì)中成為人們研究的熱點(diǎn)。細(xì)胞穿膜肽是由5-30個(gè)氨基酸組成的陽(yáng)性或兩性的短肽,具有轉(zhuǎn)染活性高,生物活性好,低毒性等優(yōu)點(diǎn),而且其自身不僅能夠高效的穿過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞,也可以介導(dǎo)其他外源性的分子進(jìn)入細(xì)胞,是目前快速發(fā)展的一種新型藥物載體。最近,細(xì)胞穿膜肽用于siRNA的細(xì)胞遞送已經(jīng)逐漸成為人們研究的熱點(diǎn)。但是作為siRNA的運(yùn)輸載體,細(xì)胞穿膜肽的攝取效率低,且不易從內(nèi)涵體內(nèi)逃出,極大地限制了細(xì)胞穿膜肽的應(yīng)用。因此,為了提高siRNA攝取效率,需要對(duì)細(xì)胞穿膜肽進(jìn)行修飾,使其能與siRNA更好地復(fù)合,使制劑更穩(wěn)定,攝取效率大大提高。本文構(gòu)建了寡聚精氨酸(R8)與siRNA的納米復(fù)合物,經(jīng)過(guò)硬脂�；途垡叶蓟謩e合成了STR-R8和STR-R8-PEG兩種不同的載體材料,制備了STR-R8/siRNA、STR-R8-PEG/siRNA和STR-R8-PEGn/siRNA三種不同的納米復(fù)合物。通過(guò)粒徑、電位、電泳行為等評(píng)價(jià)不同處方的納米復(fù)合物,篩選出理化性質(zhì)優(yōu)良的處方。并以MCF-7、HT-1080和Hela細(xì)胞為模型,考察載體與細(xì)胞之間相互作用。方法:通過(guò)查閱文獻(xiàn)及試驗(yàn),確定了壓縮材料STR-R8和STR-R8-PEG的合成和純化方法。在室溫條件下,將SA-NHS與CPP攪拌反應(yīng)30 min,純凈水透析24 h,冷凍干燥后的產(chǎn)物即為STR-R8。在室溫條件下,將STR-R8與m PEG2000-Mal避光反應(yīng)24 h,純凈水透析24 h,冷凍干燥后的產(chǎn)物即為STR-R8-PEG。通過(guò)MS對(duì)該合成產(chǎn)物進(jìn)行表征。通過(guò)參考文獻(xiàn)和大量預(yù)試驗(yàn),以siRNA為模型藥物,篩選納米復(fù)合物的處方。以制劑的粒徑、電位和瓊脂糖凝膠的電泳行為等為指標(biāo),考察制劑的理化性質(zhì),篩選出最佳的制劑處方。以MCF-7、HT-1080和Hela為細(xì)胞模型,通過(guò)流式細(xì)胞儀定量分析評(píng)價(jià)細(xì)胞攝取率,通過(guò)倒置熒光顯微鏡觀察納米復(fù)合物在細(xì)胞中的分布以及定位。結(jié)果:通過(guò)質(zhì)譜結(jié)果分析,合成得到了STR-R8和STR-R8-PEG。此方法條件溫和,方法簡(jiǎn)單快捷。通過(guò)純化能夠得到純度較高的產(chǎn)物。以siRNA為模型藥物,通過(guò)室溫孵育的方法,能夠簡(jiǎn)單快捷的制備siRNA納米復(fù)合物。以粒徑、電位和凝膠電泳行為為指標(biāo),得出STR-R8處方的粒徑在200 nm以內(nèi),Pd I比較均勻,N/P值大于等于20時(shí),能夠很好的包裹siRNA;STR-R8-PEG處方粒徑在300 nm左右,Pd I均勻,N/P值等于20時(shí),仍不能將siRNA完全包裹;因此考慮將STR-R8和STR-R8-PEG兩種載體材料按一定比例混合,制備復(fù)合載體材料STR-R8-PEGn。經(jīng)過(guò)大量試驗(yàn)最終篩選出的最佳處方為N/P比均為20的STR-R8/siRNA和STR-R8-PEG20%/siRNA。通過(guò)流式細(xì)胞儀的結(jié)果可知:在MCF-7和HT-1080兩種細(xì)胞中,與游離siRNA相比,STR-R8和STR-R8-PEG20%均能夠大大地提高siRNA的細(xì)胞攝取率。且兩種載體作用于MCF-7細(xì)胞后,其細(xì)胞攝取率均能夠達(dá)到市售試劑的水平。對(duì)于HT-1080細(xì)胞,細(xì)胞攝取率呈現(xiàn)時(shí)間依賴性,即給藥時(shí)間越長(zhǎng),細(xì)胞攝取率越大。但對(duì)于MCF-7細(xì)胞,在給藥2 h后,細(xì)胞攝取率達(dá)到最大,之后隨著時(shí)間的推移,細(xì)胞攝取率逐漸降低。通過(guò)倒置熒光顯微鏡可知:STR-R8和STR-R8-PEG20%均能夠很好地介導(dǎo)siRNA進(jìn)入細(xì)胞,并將siRNA定位在細(xì)胞質(zhì)中。結(jié)論:STR-R8和STR-R8-PEG合成方法簡(jiǎn)單快捷,條件溫和,產(chǎn)物中雜質(zhì)較少,為接下來(lái)的試驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。經(jīng)過(guò)大量試驗(yàn)篩選的處方STR-R8/siRNA和STR-R8-PEG20%/siRNA粒徑符合要求,且分布均勻,能夠完全包載siRNA。通過(guò)流式細(xì)胞儀和倒置熒光顯微鏡的結(jié)果可得STR-R8和STR-R8-PEG20%兩種載體材料能大大提高siRNA的攝取效率并且實(shí)現(xiàn)siRNA的細(xì)胞質(zhì)釋放。
【圖文】：

STR-R8純化前質(zhì)譜結(jié)果

圖 1-2 STR-R8 純化后質(zhì)譜結(jié)果Fig.1-2 Characterization of STR-R8 after dialysis in purified water with MS(m/z)
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R914

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本文編號(hào)：2559760