【摘要】：目的： 作為血管的保護(hù)傘，血管內(nèi)皮細(xì)胞能使組織液和血液通過它完成物質(zhì)代謝，而且血管內(nèi)皮細(xì)胞也能產(chǎn)生并分泌生物活性物質(zhì)用來調(diào)節(jié)凝血與抗凝平衡及血壓等特殊功能，進(jìn)而使血液流動正常和血管長期通暢。同型半胱氨酸能夠使心血管疾病的發(fā)病率升高，這跟它誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷有關(guān)。作為一種降糖藥物，二甲雙胍被研究發(fā)現(xiàn)，可以使乳腺癌與心血管疾病的發(fā)病率降低，本實驗旨在探討二甲雙胍能否降低同型半胱氨酸對血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷及其可能存在的機(jī)制。 方法： ①觀察不同溶度同型半胱氨酸（Hcy）作用血管內(nèi)皮細(xì)胞后對細(xì)胞活性的影響將實驗分為正常組、Hcy組，血管內(nèi)皮細(xì)胞接種24小時后進(jìn)行藥物處理。Hcy組分別用250μM、500μM、1000μM及2000μM溶度的Hcy處理細(xì)胞24小時；用CCK-8試劑盒檢測Hcy處理后的各組血管內(nèi)皮細(xì)胞活性。 ②觀察不同濃度二甲雙胍（Metformin）作用血管內(nèi)皮細(xì)胞后對細(xì)胞活性的影響將實驗分為正常組、Merformin組，血管內(nèi)皮細(xì)胞接種24小時后進(jìn)行藥物處理。Merformin組分別用250μM、500μM、1000μM及2000μM溶度的Merformin處理細(xì)胞24小時；用CCK-8試劑盒檢測Metformin處理后的各組血管內(nèi)皮細(xì)胞活性。 ③構(gòu)建Hcy的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型探討Merformin的干預(yù)作用及其機(jī)制將實驗分為正常組，Hcy組，Merformin組，Hcy+Merformin組。細(xì)胞接種24小時后藥物處理。Hcy組加入1000μM溶度的Hcy，Merformin組加入1000μM溶度的Merformin，Hcy+Merformin組同時加入1000μM溶度的Hcy及1000μM溶度的Merformin，然后共同作用24小時。對各組進(jìn)行以下方面檢測：CCK-8檢測各組血管內(nèi)皮細(xì)胞活性，測定血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)乳酸脫氫酶（LDH）、總超氧化物歧化酶(SOD)及谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）活性和微量丙二醛（MDA）水平，qRT-PCR測定NADPHmRNA、SODmRNA及CATmRNA的表達(dá)，WesternBlot測定p-AMPKα及t-AMPKα蛋白的表達(dá)。 結(jié)果： （1）血管內(nèi)皮細(xì)胞活性 ①與正常組比較，各溶度Hcy組血管內(nèi)皮細(xì)胞活性低(P0.05)，且隨著Hcy濃度的增加，血管內(nèi)皮細(xì)胞活性下降。 ②與正常組比較，各溶度Merformin組血管內(nèi)皮細(xì)胞活性無明顯變化(P0.05)，且內(nèi)皮細(xì)胞活性與Merformin濃度無關(guān)。 ③與正常組比較，Hcy組細(xì)胞活性低(P0.05)，Merformin組對細(xì)胞活性無明顯影響(P0.05)，而Hcy+Merformin組較Hcy組細(xì)胞活性高(P0.05)。 （2）乳酸脫氫酶(LDH)活性 與正常組比較，Hcy組的細(xì)胞LDH活性高(P0.05)，Merformin組的細(xì)胞LDH活性無明顯差異(P0.05)，Hcy+Merformin組LDH活性比Hcy組低(P0.05)，Merformin能降低Hcy導(dǎo)致的LDH活性的升高。 （3）細(xì)胞內(nèi)總SOD活性 與正常組比較，Hcy組的細(xì)胞總SOD活性低(P0.05)，Merformin組的細(xì)胞總SOD活性無明顯差異(P0.05)。Hcy+Merformin組總SOD活性比Hcy組高(P0.05)，Merformin能緩和Hcy導(dǎo)致的總SOD活性的降低。 （4）丙二醛(MDA)的生成水平 與正常組比較，Hcy組細(xì)胞MDA的生成水平高(P0.05)，Merformin組的細(xì)胞MDA的生成水平無明顯差異(P0.05)。Hcy+Merformin組細(xì)胞MDA的生成水平生成水平比Hcy組低(P0.05)，Merformin能降低Hcy導(dǎo)致的細(xì)胞MDA的增加。 （5）谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）活性 與正常組比較，Hcy組的谷胱甘肽過氧化物酶活性低(P0.05)，Merformin組的細(xì)胞谷胱甘肽過氧化物酶活性無明顯差異(P0.05)。Hcy+Merformin組谷胱甘肽過氧化物酶活性比Hcy組高(P0.05)，Merformin能緩和Hcy導(dǎo)致的谷胱甘肽過氧化物酶活性的降低。 （6）NADPHmRNA的表達(dá)量 與正常組比較，Hcy組的細(xì)胞NADPHmRNA的表達(dá)量高(P0.05)，Hcy+Merformin組細(xì)胞NADPHmRNA的表達(dá)量比Hcy組低(P0.05)，Merformin能降低Hcy導(dǎo)致的細(xì)胞NADPHmRNA的表達(dá)量的升高。 （7）SODmRNA的表達(dá)量 與正常組比較，Hcy組的細(xì)胞SODmRNA的表達(dá)量低(P0.05)，Hcy+Merformin組細(xì)胞SODmRNA的表達(dá)量比Hcy組高(P0.05)，Merformin能緩和Hcy導(dǎo)致的細(xì)胞SODmRNA的表達(dá)量的降低。 （8）CATmRNA的表達(dá)量 與正常組比較， Hcy組的細(xì)胞CATmRNA的表達(dá)量低(P0.05)，Hcy+Merformin組細(xì)胞CATmRNA的表達(dá)量比Hcy組高(P0.05)，Merformin能緩和Hcy導(dǎo)致的細(xì)胞CATmRNA的表達(dá)量的降低。 （9）p-AMPKα及t-AMPKα蛋白的表達(dá)量。 與正常組比較，各實驗組的t-AMPKα蛋白的表達(dá)量無明顯差異(P0.05)；與正常組比較，Hcy組的p-AMPKα蛋白的表達(dá)量無明顯差異(P0.05)，Merformin組及Hcy+Merformin組的p-AMPKα蛋白的表達(dá)量升高(P0.05)。Merformin使細(xì)。胞內(nèi)p-AMPKα/t-AMPKα的比值升高，從而使AMPKα的磷酸化水平升高。結(jié)論： ①同型半胱氨酸能使血管內(nèi)皮細(xì)胞的活性降低，且隨著同型半胱氨酸的增加，對血管內(nèi)皮細(xì)胞的活性影響越大，其影響內(nèi)皮細(xì)胞活性降低與誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)氧自由基、MDA、LDH、NADPH等水平或活性上升，而使細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶SOD、CAT、GSH-PX等活性降低有關(guān)。 ②Merformin對血管內(nèi)皮細(xì)胞活性無明顯影響(P0.05)，且內(nèi)皮細(xì)胞活性與Merformin濃度無關(guān)。 ③二甲雙胍可以降低同型半胱氨酸對內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，可能的機(jī)制是通過激動AMPK通路，使磷酸化的AMPK增加，從而緩和同型半胱氨酸誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)氧自由基、MDA、LDH、NADPH等水平或活性上升，抗氧化酶SOD、CAT、GSH-PX等活性降低。
【圖文】：

倒置顯微鏡下觀察，EC304 細(xì)胞貼壁生長，，單個細(xì)胞形態(tài)可呈現(xiàn)三角形、梭型為主，細(xì)胞漿為透明、細(xì)胞核圓型，細(xì)胞生長融合后呈現(xiàn)鋪路石樣（圖 1）。當(dāng)細(xì)胞鋪滿 90%左右瓶底用含 EDTA 胰酶進(jìn)行 1：3 傳代。細(xì)胞傳代后大約 40 分鐘開始貼壁，大約 6-8 小時貼壁完全，剛貼壁時為圓形，約 12 小時成為梭形或多角形。36 小時后可長滿 80%瓶底。

純二甲雙胍作用 24 小時后，CCK-8 檢測細(xì)胞活性。%，其余各組細(xì)胞活性與正常組比較百分比為：，500 μM 組為 98.5±4.02%，1000 μM 組為 101.6±3.0.27%。通過統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，各濃度組與正常組比較細(xì)度無關(guān)（P>0.05）（見圖 3）。
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R96

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 王建華;李清;胡玉堂;;二甲雙胍對高血壓合并2型糖尿病患者血壓及血脂的影響[J];現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志;2008年24期

2 王紅;楊春紅;瑪依拉;;二甲雙胍對糖耐量減低患者血清炎癥標(biāo)志物的影響[J];現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生;2008年06期

本文編號：2558538