【摘要】：胰島素原(Proinsulin,Pins)是胰島素的合成前體。在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中,其一般以包涵體的形式存在,需要經(jīng)過變性復(fù)性等后續(xù)加工過程才能得到有活性的胰島素。而無細(xì)胞蛋白合成體系(Cell-free protein synthesis,CFPS)作為一種新型體外蛋白合成手段,突破了細(xì)胞的生理限制,已成功應(yīng)用于多種重組蛋白藥物的生產(chǎn)。為了探索胰島素合成的新方法以滿足其在新型給藥途徑研發(fā)中的需求,本研究運(yùn)用CFPS體系進(jìn)行胰島素原的可溶性表達(dá)。通過將胰島素原與熒光蛋白進(jìn)行融合來增加其可溶性,成功在CFPS體系中表達(dá)了胰島素原融合蛋白。最后使用Western blotting對(duì)融合紅色熒光蛋白的胰島素原(Pins-mCherry)進(jìn)行鑒定,利用酶標(biāo)儀對(duì)融合綠色熒光蛋白的胰島素原(Pins-eGFP)在上清中的表達(dá)進(jìn)行定量分析,結(jié)果表明Pins-eGFP部分可溶,其表達(dá)量為(12.28±3.45)μg/m L。本研究首次實(shí)現(xiàn)了融合胰島素原在CFPS系統(tǒng)中的可溶性表達(dá),其融合熒光蛋白的策略顯著提升了胰島素原的可溶性,該結(jié)果為探究胰島素合成新方法及開發(fā)基于CFPS系統(tǒng)的新型胰島素給藥途徑奠定了基礎(chǔ)。
【圖文】：

胡元等/無細(xì)胞蛋白合成體系實(shí)現(xiàn)胰島素原可溶性表達(dá)：010-64807509：cjb@im.ac.cn471對(duì)融合蛋白徻行切從而實(shí)現(xiàn)成熟胰島在CFPS系中的合成。在需要時(shí)，為了于儲(chǔ)存和運(yùn)輸，可以這些組分分制成凍干粉，需要時(shí)通過加入水起始反應(yīng)即可獲得胰島。圖1E.coli生產(chǎn)胰島素流程圖及CFPS合成胰島素的示意圖(改編自文獻(xiàn)[16])。(A)E.coli生產(chǎn)胰島素流程圖。(B)新型CFPS合成胰島素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。Fig.1TheoverallprocessofinsulinproductioninE.coliandtheschematicviewofCFPSinsulinproduction[16].(A)TheprocessofproducinginsulininE.coli.(B)ThedesignofCFPSbasedinsulinproduction.2.2質(zhì)粒構(gòu)建達(dá)胰島原的重組質(zhì)粒及融合熒光蛋白的胰島原達(dá)質(zhì)粒的設(shè)計(jì)如圖2所示。胰島原基因QJ隆至載pET-28a(+)獲得重組質(zhì)粒pYH1，經(jīng)NdeⅠ和HindⅢ雙酶切驗(yàn)證，，獲得產(chǎn)物長度為268bp，與理論長度一致(圖3)。為了實(shí)現(xiàn)胰島原的可溶性達(dá)，構(gòu)建了融合紅色熒光蛋白(mCherry)的胰島原重組質(zhì)粒pYH2，通過PCR分?jǐn)U增mCherry基因片段和重組質(zhì)粒pYH1，獲得產(chǎn)物長度為778bp和5535bp，結(jié)果與預(yù)期符。由于pYH2載上有2個(gè)NcoⅠ酶切點(diǎn)，使用NcoⅠ單酶切驗(yàn)證重組質(zhì)粒，獲得2個(gè)片段，長度分為5433bp和780bp，與理論長度符，證明重組質(zhì)粒pYH2構(gòu)建成功(圖4)。構(gòu)建編碼融合綠色熒光蛋白(eGFP)與胰島原融合基因重組質(zhì)粒pYH3，PCR分?jǐn)U增eGFP基因片段和重組質(zhì)粒pYH1，獲得產(chǎn)物長度為787bp和5535bp，結(jié)果與預(yù)期長度符。

ISSN1000-3061CN11-1998/QChinJBiotechMarch25,2017Vol.33No.3http://journals.im.ac.cn/cjbcn472以NcoⅠ和ClaⅠ雙酶切驗(yàn)證重組質(zhì)粒，獲得2個(gè)片段，長度分為3819bp和2403bp(圖5)，證明重組質(zhì)粒pYH3構(gòu)建成功。同時(shí)在pYH2和pYH3質(zhì)粒中胰島原與熒光蛋白之間均加入了氨基酸序列為PSCSSPSP的連以融合對(duì)蛋白折的影響。圖2本研究所構(gòu)建的質(zhì)粒示意圖。(A)表達(dá)胰島素原的重組質(zhì)粒pYH1的構(gòu)建。(B)融合紅色熒光蛋白的胰島素原重組質(zhì)粒pYH2的構(gòu)建。(C)融合綠色熒光蛋白的胰島素原重組質(zhì)粒pYH3的構(gòu)建。Fig.2Schematicviewofconstructedrecombinantplasmids.(A)ConstructionofproinsulinexpressionplasmidpYH1.(B)ConstructionofrecombinantplasmidpYH2forexpressionofmCherry-proinsulinchimericprotein.(C)ConstructionofrecombinantplasmidpYH3forexpressionofeGFP-proinsulinchimericprotein.圖3pins基因的PCR擴(kuò)增及質(zhì)粒pYH1的酶切驗(yàn)證結(jié)果。(A)PCR擴(kuò)增胰島素原基因(pins)。(B)表達(dá)胰島素原的重組質(zhì)粒pYH1的雙酶切驗(yàn)證。Fig.3PCRamplificationresultofpinsandconfirmationofpYH1.(A)PCRamplificationofpinsgene.M:DL2000DNAmarker;lane1:PCRproductofpinsgene.(B)ConfirmationofrecombinantplasmidpYH1byNdeⅠandHindⅢdoubledigestion.M:DL2000DNAmarker;lane1:productsfromrecombinantplasmiddoubledigestedbyNdeⅠandHindⅢ.2.3CFPS表達(dá)eGFP的紫外透照儀檢測為確定本次構(gòu)建的CFPS系能合成蛋白質(zhì)，在CFPS系中加入編碼eGFP基因的質(zhì)粒，用CFPS合成eGFP，采用外透照儀使用365nm波長徻行步檢測。結(jié)果如圖6所示，證明構(gòu)建的CFPS系能成功達(dá)eGFP蛋白，可用于后續(xù)蛋白質(zhì)的外合成。2.4CFPS表達(dá)胰島素原的Westernblotting分析在證明CFPS系
【作者單位】： 武漢大學(xué)中南醫(yī)院內(nèi)分泌科;武漢大學(xué)藥學(xué)院組合生物合成與新藥S蝸紙?zhí)育部重甸`笛槭

本文編號(hào)：2548902