發(fā)布時(shí)間：2019-09-25 04:38

【摘要】：目前輸血面臨血源不足、保存和使用中需血液配型、血液保質(zhì)期有限、血源性疾病的傳播及通用性受限等問題。血液代用品是血源不足的必要補(bǔ)充,其中血紅蛋白氧載體(Hemoglobin based oxygen carriers,HBOCs)作為血液代用品的一種,為當(dāng)今研究熱點(diǎn)。血紅蛋白(Hemoglobin,Hb)作為紅細(xì)胞中的主要成分起到輸氧作用,有望代替血液維持組織氧穩(wěn)態(tài)。通過表面修飾、分子內(nèi)交聯(lián)及分子間聚合等方式對游離血紅蛋白進(jìn)行化學(xué)修飾以改變其性質(zhì),使其安全、有效地替代紅細(xì)胞的攜氧功能。從20世紀(jì)90年代開始,多種基于血紅蛋白改性的血液代用品進(jìn)入臨床試驗(yàn)的不同階段,然而臨床試驗(yàn)中副反應(yīng)發(fā)生、病死率升高等原因是限制血液代用品臨床應(yīng)用的主要因素。盡管HBOC的安全性問題仍制約其臨床應(yīng)用,但是在血液無法滿足輸血需求的情況下,HBOC因其挽救生命的作用受到研究者們的關(guān)注。納米載藥系統(tǒng)為新型HBOC的設(shè)計(jì)與研究提供思路。以脂質(zhì)體或可降解高分子聚合物材料為殼材包裹Hb形成的一類納米微囊型血液代用品,克服了無基質(zhì)血紅蛋白無細(xì)胞膜屏障的缺點(diǎn)。該類HBOC具有避免血管活性,延長血紅蛋白半衰期,無需修飾Hb四聚體,防止Hb本身引起的膠體滲透壓升高等優(yōu)點(diǎn),逐漸成為新一代HBOCs的研究熱點(diǎn)�？山到飧叻肿硬牧蠙C(jī)械強(qiáng)度高,可制成多孔性膜,以其為殼材包裹Hb穩(wěn)定性高,解決了脂質(zhì)體微囊機(jī)械強(qiáng)度低和小分子物質(zhì)通透性差的局限性,通過控制粒徑大小、表面電荷和表面修飾物等有望滿足血液代用品的研發(fā)需求。目前用可降解高分子材料包裹Hb的研究中以聚乳酸(poly lactic acid,PLA)為代表研究較多。研究發(fā)現(xiàn),在PLA中引入羥基乙酸,即聚乳酸-羥基乙酸(poly(D,L-lactide-co-gly-colide),PLGA),可以增大彈性模量、提高親水性。同時(shí),PLGA具有良好的生物可降解性及生物相容性,己被美國FDA批準(zhǔn)作為藥用輔料進(jìn)入美國藥典,近年來已大量應(yīng)用于緩釋藥物載體。考慮到HBOC需經(jīng)靜脈大劑量輸注,提高納米粒子的彈性模量和親水性有望提高生物相容性,因此PLGA相較于PLA可能更適用于HBOCs的研究。另外,聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)修飾不僅能夠減少血漿蛋白的吸附作用,減少網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的清除作用,而且能夠改善生物相容性,維持Hb活性,本研究擬用甲氧基聚乙二醇-聚乳酸羥基乙酸(methoxy polyethylene glycol-poly(D,L-lactide-co-gly-colide),m PEG-PLGA)包裹牛血紅蛋白目的在于獲得穩(wěn)定性高、Hb不易氧化的載Hb納米粒子(Hemoglobin loaded nanoparticles,Hb Ps)。通過篩選Hb Ps制備工藝,并對其理化性質(zhì)、在急性失血中的救治效果和生物相容性進(jìn)行初步評估,探討Hb Ps作為血液代用品的可行性,為納米微囊型血液代用品提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。由于HBOCs粒徑小,可以通過管徑細(xì)的血管向缺氧組織釋放氧氣,因此HBOCs除了在臨床輸血中進(jìn)行全身應(yīng)用,在心肌梗死、腦梗死等局部缺血損傷中以及提高腫瘤放化療敏感度也具有應(yīng)用潛力。鑒于局部缺血疾病無需全身大劑量靜脈灌注HBOCs,靶向治療可提高生物利用率,減輕毒副作用。考慮到HBOCs需參與全身血液循環(huán)發(fā)揮供氧功能,而磁靶向治療可以使磁性納米粒子在磁場作用下富集到病灶部位,去除磁場后在血流作用下進(jìn)行全身循環(huán),因此本研究將在Hb Ps研究的基礎(chǔ)上采用磁靶向治療策略初步建立一種靶向HBOCs制備關(guān)鍵技術(shù),探討靶向治療理念應(yīng)用于HBOCs研究的可行性。本研究將利用m PEG-PLGA通過雙乳法制備載血紅蛋白納米粒子(Hemoglobin loaded nanoparticles,Hb Ps),初步評估Hb Ps的理化參數(shù)、生物相容性和有效性,探討利用m PEG-PLGA制備Hb Ps作為血液代用品的可行性。初步建立靶向HBOCs關(guān)鍵技術(shù),以期為拓寬HBOCs臨床應(yīng)用領(lǐng)域提供理論依據(jù)。本課題將分為以下三個(gè)部分:一、Hb Ps的制備及其理化性質(zhì)由于w/o/w雙乳法的制備條件溫和,制備過程避免了聚合物與蛋白直接接觸,適用于包裹Hb這類空間構(gòu)象與攜氧功能關(guān)系密切的蛋白質(zhì),且制備的納米粒子穩(wěn)定性高,因此本研究利用w/o/w雙乳法制備Hb Ps。為建立Hb Ps的制備技術(shù),本研究探討了雙乳法制備中乳化劑、有機(jī)相/水相的比例以及有機(jī)溶劑的種類對Hb Ps的粒徑大小、粒徑分布和包封率等理化性質(zhì)的影響。根據(jù)Hb Ps可見光譜中Soret帶的特征光譜,篩選出乙酸乙酯為有機(jī)溶劑能保持Hb在制備過程中不被氧化。多聚物濃度為20 mg/ml,Hb濃度為120 mg/ml,乳化劑PVA與F68比例為7:3時(shí),制備的Hb Ps粒徑大小為196.3 nm,粒徑分布均一。通過Hb Ps的可見光譜、傅里葉變換紅外光譜和圓二色譜圖證實(shí)了上述條件制備Hb Ps對Hb的結(jié)構(gòu)和功能無明顯影響。通過測定Hb Ps的釋氧曲線,證實(shí)了Hb Ps具有攜氧-釋氧功能。優(yōu)選條件下制備的Hb Ps懸液在37oC放置7天,粒徑維持在200 nm左右,Hb累積釋放率為1.78±0.09%,在4oC保存42天,Hb累積釋放率維持在0.50±0.01%,證實(shí)了Hb Ps具有良好的穩(wěn)定性。二、Hb Ps的血液相容性及有效性評估。鑒于血液代用品用于靜脈注射且臨床使用輸注量大,本研究初步評估Hb Ps血液相容性和有效性。通過黏度測定、紅細(xì)胞聚集試驗(yàn)、凝血試驗(yàn)和溶血試驗(yàn)初步評價(jià)Hb Ps對血液成分(血漿、血小板和紅細(xì)胞等)的影響。結(jié)果表明Hb Ps具有與全血相似的黏度特性,根據(jù)Hb Ps與離體人血直接接觸后的血栓彈力圖,證實(shí)了Hb Ps不引起凝血功能變化,且Hb Ps與紅細(xì)胞孵育后無明顯溶血作用,不會引起紅細(xì)胞聚集,上述結(jié)果初步證實(shí)Hb Ps具有良好的血液相容性。將雄性Bal B/c小鼠隨機(jī)分為NS組(生理鹽水組)、RBC組(懸浮紅細(xì)胞組)和Hb Ps組,通過建立小鼠控制性失血模型,監(jiān)測動物在失血前、失血后和輸液后的血壓變化和治療后的血?dú)饨Y(jié)果,評價(jià)Hb Ps對控制性失血小鼠的救治效果。結(jié)果表明Hb Ps在治療控制性失血小鼠過程中能夠維持平均動脈壓,改善混合靜脈氧分壓。三、磁性Hb Ps及其靶向性研究。針對局部缺氧疾病靶向供氧需求,為提高Hb Ps生物利用率,以Hb Ps為基礎(chǔ)包裹Fe2O3磁流體賦予Hb Ps磁靶向性能,制備Mag-Hb Ps(Magnetic hemoglobin loaded nanoparticles,Mag-Hb Ps)。根據(jù)透射電鏡圖、可見光譜圖、圓二色譜圖和釋氧曲線,說明Mag-Hb Ps為規(guī)則球形,且Fe2O3磁流體對Hb結(jié)構(gòu)和功能無明顯影響。通過測定磁滯回線和體外磁響應(yīng)實(shí)驗(yàn),證實(shí)了Mag-Hb Ps具有超順磁性和良好的磁響應(yīng)性。在流動裝置中考察了流速對Mag-Hb Ps磁靶向作用,隨著流速降低Mag-Hb Ps磁靶向聚集明顯,去除磁場后Mag-Hb Ps聚集體隨流體剪應(yīng)力作用消失。根據(jù)溶血試驗(yàn)和凝血試驗(yàn)的研究結(jié)果證實(shí)了Mag-Hb Ps的血液相容性良好。在Mag-Hb Ps中加入熒光標(biāo)記Di R,利用小鼠活體熒光成像技術(shù),在磁場作用下示蹤Mag-Hb Ps分布情況,證實(shí)了Mag-Hb Ps的體內(nèi)磁靶向作用。綜上所述,本研究證實(shí)了m PEG-PLGA可以用于納米微囊型HBOCs的制備,該品種HBOCs形態(tài)規(guī)則,粒徑均一,穩(wěn)定性高,制備過程能夠維持Hb結(jié)構(gòu)和功能,血液相容性良好,可以恢復(fù)組織氧供,為該類HBOCs的研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。通過在Hb Ps制備過程中加入磁流體制備具有磁靶向功能的Mag-Hb Ps,初步建立了靶向HBOCs關(guān)鍵技術(shù),為拓寬血液代用品臨床適用性提供支撐。
【圖文】：

微量 Hb 測定試劑盒（博邁德公司）其他試劑均為國產(chǎn)分析純。1.3 方法1.3.1 Hb 溶液的制備將取自魯西黃牛的新鮮血液離心，獲得紅細(xì)胞，洗滌溶脹使紅細(xì)胞膜破裂得到的 Hb 溶液，將 Hb 溶液微濾和超過濾，再通過陰離子交換層析柱純化，制備高純度 Hb 溶液，經(jīng) SDS-PAGE 測定 Hb 溶液純度高，經(jīng)血?dú)夥治鰞x測定，Hb總濃度為 25.2 g/dL，HbO2含量為 97.4 %，MetHb 含量為 2.6 %。MetHb 溶液的制備[62]：將 1.4 mg/ml K3Fe(CN)6加入 Hb 溶液中混合，通過血?dú)夥治鰞x測定 MetHb 含量大于 90%，即為 MetHb 溶液。1.3.2 HbPs 的制備PEG-PLGA 包裹 Hb 制備 HbPs 的過程如圖 1-1 所示。

圖 1-2 OxyHb 和 MetHb 在 350-650nm 處的特征光譜圖圖 1-3 所示為 7 組 HbPs 的特征光譜，在 Soret 帶和 Q 帶出現(xiàn)三個(gè)特征峰，主要表現(xiàn)為 Hb 的特征光譜。對比 OxyHb 和 MetHb 的特征光譜圖，HbP2 組的Soret 帶特征峰位在 412 nm，主要反映了 OxyHb 的光譜特征，HbP1、HbP3、HbP4HbP5、HbP6 和 HbP7 組的 Soret 帶特征峰位在 405 nm，主要反映了 MetHb 的光譜特征，說明在 HbP1、HbP3、HbP4、HbP5、HbP6 和 HbP7 組中 Hb 被氧化，在 HbP2 組條件下，即用乙酸乙酯作為有機(jī)溶劑制備 HbP 時(shí) Hb 不易被氧化。
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R91

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本文編號：2541241