【摘要】：為從Myxococcus macrosporus STXZ54發(fā)酵液中高效地分離純化出抗腫瘤活性蛋白WGF5,收集STXZ54發(fā)酵上清液,先后利用優(yōu)化后的硫酸銨沉淀方法沉淀蛋白,強陽離子交換、分子篩色譜分離等方法對蛋白粗提物進行精細分離.利用CCK-8試劑盒,倒置顯微鏡、掃描電子顯微鏡等觀察WGF5對腫瘤細胞形態(tài)的影響,臺盼藍染色進一步檢測WGF5對腫瘤細胞的毒力.實驗結果觀察到WGF5能夠顯著改變腫瘤細胞形態(tài),與原分離體系相比較,優(yōu)化后的抗腫瘤活性蛋白分離方法更為高效,簡便易行.
【圖文】：

7721的毒力將在六孔板接種的細胞置于細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)12h，實驗組加入10mg/LWGF5，而對照組加入相同體積的PBS，實驗組和對照組都做相同時間梯度:0，24，36，48，60h．收集細胞PBS洗滌2次后，80μL無菌去離子水重懸細胞，然后加入80μL臺盼藍染色液常溫染色5min，細胞用血球計數(shù)板進行計數(shù)，計算細胞的死亡率．2結果與分析2．1硫酸銨分級沉淀抗腫瘤活性蛋白利用硫酸銨分級沉淀梯度分別為0%～35%，35%～70%，70%～100%，40%～75%分級沉淀出的4組蛋白，作用B16腫瘤細胞24h，CCK-8試劑盒測定各組樣品的腫瘤細胞抑制率．實驗結果如圖1-a所示，各飽和度下沉淀的蛋白均對兩種腫瘤細胞具有細胞毒性，且35%～70%飽和度區(qū)沉淀出蛋白的細胞毒性為83%，顯著高于其他三組蛋白的抗腫瘤活性．硫酸銨分級沉淀濃度為40%～75%時(原方法所使用的硫酸銨分級沉淀濃度梯度)，其沉淀出的蛋白細胞毒性在73%左右．SDS-PAGE檢測硫酸銨分級沉淀梯度分別為35%～70%(圖1-b，泳道1)、40%～75%(圖1-b，泳道2)沉淀出的兩組樣品的蛋白條帶發(fā)現(xiàn)，二者蛋白成分相近，且35%～70%硫酸銨分級沉淀出的蛋白中WGF5含量較高．因此，考慮選用35%～70%硫酸銨梯度沉淀法沉淀抗腫瘤活性蛋白．2．2強陽離子交換色譜分離抗腫瘤活性蛋白將提取的抗腫瘤活性粗提蛋白用強陽離子交換色譜進行分離，分離結果如圖2-a所示，圖中出現(xiàn)兩個色譜峰，穿透峰(峰A)在色譜程序開始后不久就被洗脫下來，峰面積較大，最高點接近3500mAU．緊隨峰A被洗脫下來的色譜峰(峰B)，保留時間為6．5min．收集各峰進行細胞毒性實驗，并對A和B兩活性峰進行SDS-PAGE檢測，結果表明WGF5在峰B中．大量收集活性峰B，進行下一步分離純化．圖1硫酸銨沉淀分離抗腫瘤活性蛋白Fig．1Separationofantitumoractiveproteinsbyammoniumsulfateprec

魏慧等:大孢粘球菌抗腫瘤活性蛋白WGF5分離方法的優(yōu)化與活性分析圖3分子篩色譜分離抗腫瘤活性蛋白Fig．3Separationofantitumoractiveproteinsbymolecularsievechromatography圖4SDS-PAGE檢測活性蛋白純度Fig．4DetactionofproteinsbySDS-PAGE2．5臺盼藍染色觀察WGF5對B16細胞的毒性作用用4%臺盼藍染色液對WGF5作用不同時間的B16細胞進行染色．早期凋亡的細胞及未死亡的細胞中細胞膜結構較完整，不易被臺盼藍染液染成藍色，從而可以通過這種染色手段將活細胞與死細胞區(qū)分開來．從圖5可以看出，隨作用細胞的時間增大，被染色的死細胞數(shù)目比例逐漸增加．在WGF5作用48h后，細胞死亡比例達到了67%，而之前CCK-8試劑盒測得細胞死亡率在67%之上，，可以分析得出在CS3作用細胞期間，細胞可能發(fā)生了早期凋亡．2．6掃描電子顯微鏡觀察細胞形態(tài)變化掃描電子顯微鏡觀察WGF5對B16細胞形態(tài)的影響，結果如圖6所示，在對照組中，B16細胞具有明顯的細胞形態(tài)變化，細胞形態(tài)正常．實驗組中B16細胞的細胞偽足消失，細胞結構坍塌瓦解，細胞變圓死亡，足見WGF5對人臍帶靜脈內(nèi)皮細胞沒有明顯的毒力．圖5WGF5對腫瘤細胞存活率的統(tǒng)計分析Fig．5StatisticalanalysisoftheB16cellssurvivalratewhentreatedwithWGF5圖6掃描電鏡觀察B16細胞的形態(tài)變化(8000×)Fig．6B16cellswereanalyzedwithscanningelectronmicroscopy(8000×)3討論粘細菌是最高級的微生物類群，科研工作者從中挖掘抗腫瘤新藥物的研究體系也日趨完善［14］．就目前研究現(xiàn)狀來看，粘細菌抗腫瘤新藥物的開發(fā)潛力遠大于放線菌［15］．2014年Jansen等從粘細菌Nannocystispu-sillaNaa174菌株中分離得到的pyrronazolsC1和C2兩種活性物質對多種腫瘤細胞系均有抑制作用，其中對人卵巢癌細胞SK-OV-3的活性?
【作者單位】： 湖南師范大學生命科學學院微生物分子生物學湖南省重點實驗室淡水魚類發(fā)育生物學國家重點實驗室;
【基金】：國家“973”基礎研究計劃資助項目(2012CB722301) 湖南省“生物發(fā)育工程及新產(chǎn)品研發(fā)協(xié)同創(chuàng)新中心”資助項目(20134486)
【分類號】：R915

【相似文獻】

相關期刊論文 前10條

1 劉元江;;組蛋白去乙酰化酶抑制劑的抗腫瘤活性[J];國外醫(yī)學(藥學分冊);2007年01期

2 周雙生;程俊;賈勇;謝復新;;新型鉑(Ⅱ)配合物的合成及其抗腫瘤活性[J];化學試劑;2007年06期

3 王海英;張麗萍;葛文中;;甾體肟的合成及抗腫瘤活性的研究[J];黑龍江八一農(nóng)墾大學學報;2011年01期

4 馮娟;李建其;;N-(氨基吡啶)苯甲酰胺類衍生物的合成與抗腫瘤活性[J];藥學學報;2009年12期

5 吳春華;陳藝勤;邱恬;姚閩娜;龐杰;;多糖微觀構象與抗腫瘤活性關系研究進展[J];中國糧油學報;2011年04期

6 陳衛(wèi)民,曾隴梅,徐繼紅,吳曙光;3,3’-(二硒雙甲叉)雙(5-羥基-6-甲基4-吡啶甲醇)的合成及抗腫瘤活性[J];解放軍藥學學報;1999年03期

7 陳琪,朱海亮,戚穗堅,彭文烈,徐安龍;六氮雜大環(huán)希夫堿與銀(Ⅰ)系列配合物的抗腫瘤活性研究[J];中山大學學報(自然科學版);2001年02期

8 王新楊;徐浩;吳曉明;黃文龍;周金培;;異穿心蓮內(nèi)酯衍生物的合成及其抗腫瘤活性[J];中國藥科大學學報;2005年06期

9 周燕;趙硯瑾;李庶心;鄧曉東;;苯丙烯酰胺類化合物的合成及抗腫瘤活性研究[J];解放軍藥學學報;2012年02期

10 胡揚根;高海濤;王剛;王燕;屈永年;徐靖;;新型2-氨基-呋喃并[2,3-d]嘧啶-4(3H)-酮衍生物的合成及抗腫瘤活性[J];有機化學;2012年08期

相關會議論文 前10條

1 楊會成;曾名勇;董士遠;劉尊英;李瑞雪;郭玉華;;海帶多酚的分離、純化及抗腫瘤活性[A];2007年中國水產(chǎn)學會學術年會暨水產(chǎn)微生態(tài)調控技術論壇論文摘要匯編[C];2007年

2 胡人杰;;我國天然抗腫瘤活性成分的研究進展[A];2007醫(yī)學前沿論壇暨第十屆全國腫瘤藥理與化療學術會議論文集[C];2007年

3 張巖;高世勇;季宇彬;;多糖結構修飾對抗腫瘤活性影響的研究進展[A];第六屆肉蓯蓉暨沙生藥用植物學術研討會論文集[C];2011年

4 尚海;陳虹;郝飛躍;劉永峰;潘莉;程卯生;;新型吲哚衍生物的設計、合成及抗腫瘤活性研究[A];2010年中國藥學大會暨第十屆中國藥師周論文集[C];2010年

5 黃燕敏;崔建國;甘春芳;宋化燦;;6-取代-4-氮雜-A-homo-3-氧代膽甾化合物的合成及抗腫瘤活性研究[A];中國化學會第27屆學術年會第06分會場摘要集[C];2010年

6 王朋;畢秀麗;郭玉梅;樸虎日;趙余慶;;25-OH-PPD脂肪酸酯類衍生物的合成和抗腫瘤活性評價[A];2011年中國藥學大會暨第11屆中國藥師周論文集[C];2011年

7 馮貝貝;周廣強;于康;王惠;張秋榮;劉宏民;;2-吲哚酮衍生物的合成及抗腫瘤活性評價[A];2011年全國藥物化學學術會議——藥物的源頭創(chuàng)新論文摘要集[C];2011年

8 劉丹;李曉靜;鄭小洲;盛志成;霍春芳;趙臨襄;;2-(E)-取代-苯基亞甲基-6-(N-取代-胺甲基)環(huán)己酮/環(huán)己醇類化合物的合成及抗腫瘤活性研究(英文)[A];第十一屆全國青年藥學工作者最新科研成果交流會論文集[C];2012年

9 侯寶龍;王翠玲;張寧;劉建利;;喹喔啉類衍生物的合成和抗腫瘤活性研究[A];第十一屆全國博士生學術年會（生物醫(yī)藥專題）論文集（中冊，墻報P1-P24）[C];2013年

10 宣偉;丁雯;李義平;惠宏襄;張三奇;;4-甲基哌嗪甲酰基二芳基脲的合成和抗腫瘤活性[A];2011年全國藥物化學學術會議——藥物的源頭創(chuàng)新論文摘要集[C];2011年

相關博士學位論文 前10條

1 陳靜;咔啉及其類似物的設計、合成及抗腫瘤活性研究[D];浙江大學;2009年

2 李德海;深海微生物次級代謝產(chǎn)物的抗腫瘤活性成分研究[D];中國海洋大學;2007年

3 畢重文;新型N-取代槐定酸類似物的設計、合成及其抗腫瘤活性研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學院;2015年

4 張穎杰;新型組蛋白去乙�；敢种苿┑脑O計、合成及抗腫瘤活性研究[D];山東大學;2012年

5 李靜;（R）-四氫噻唑-2-硫酮-4-羧酸的應用研究兼論羧酸金剛烷胺鹽的合成及抗腫瘤活性[D];吉林大學;2008年

6 田智勇;酰亞胺衍生物合成與抗腫瘤活性評價[D];天津大學;2009年

7 劉紅椿;桔霉素三聚體Tricitrinol B的抗腫瘤活性及機制研究[D];中國海洋大學;2009年

8 郭淑春;3-芳基-8H-噻吩并［2，3-b］吡咯里嗪類化合物的設計、合成與抗腫瘤活性研究[D];沈陽藥科大學;2007年

9 袁健;手性釕配合物Λ-WH0402的抗腫瘤活性及其作用機制[D];南方醫(yī)科大學;2010年

10 黃偉;新型類黃酮衍生物的設計、合成及抗腫瘤活性研究[D];華中師范大學;2008年

相關碩士學位論文 前10條

1 王紅葉;葉酸介導白蛋白包載長春堿納米粒體內(nèi)外抗腫瘤活性評估[D];東北林業(yè)大學;2015年

2 吳永成;基于環(huán)高價碘摀鹽的菲和咔唑類化合物的構建、表征分析及其抗腫瘤活性研究[D];廣東藥學院;2015年

3 李祥華;新型吉西他濱衍生物的設計、合成及其抗腫瘤活性研究[D];安徽中醫(yī)藥大學;2015年

4 頓艷艷;嘧啶芐基異羥肟酸類靶向抑制劑的設計、合成與抗腫瘤活性研究[D];山東大學;2015年

5 劉豐喜;多取代靛紅衍生物的合成與抗腫瘤活性研究[D];天津科技大學;2014年

6 楊康利;南極海洋芽孢桿菌多肽PBN11-8的分離純化及抗腫瘤活性研究[D];青島科技大學;2015年

7 侯金寧;APN抑制劑LJNK與基于APN的協(xié)同前藥BC-A1的抗腫瘤活性研究[D];山東大學;2016年

8 李敏;含噻唑并[3,2-b][1,2,4]三唑-6(5H)-酮等結構的考布他汀A4衍生物的合成及抗腫瘤活性研究[D];延邊大學;2016年

9 王春蘭;ATB-429和IMB-1506衍生物的設計、合成與抗腫瘤活性研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學院;2016年

10 張卉;新型喜樹堿類化合物ZH-001的抗腫瘤活性及其分子機制研究[D];浙江工業(yè)大學;2016年

本文編號：2538874