【摘要】：目的:以可分裂的GFP蛋白作為基礎(chǔ),本研究了建立熒光蛋白系統(tǒng),模擬細(xì)胞內(nèi)蛋白降解的途徑。利用此系統(tǒng)篩選了可能對(duì)ER產(chǎn)生作用的藥物,并對(duì)這些藥物做出基本檢測,確定其確實(shí)的抗腫瘤作用。同時(shí)通過另外一種檢測方式,來證實(shí)此系統(tǒng)篩選藥物的可行性。從而為以后藥物性質(zhì)的檢測提供可行的簡單途徑。方法:利用限制性酶切,我們將可分裂的GFP蛋白S-1端連接在表達(dá)錯(cuò)誤折疊蛋白的質(zhì)粒上,再轉(zhuǎn)染至細(xì)胞,同時(shí)將S-10端轉(zhuǎn)入細(xì)胞中,使其在細(xì)胞質(zhì)中穩(wěn)定表達(dá)。先用蛋白酶抑制劑(MG132)阻斷持續(xù)表達(dá)錯(cuò)誤蛋白的熒光細(xì)胞的蛋白降解途徑,細(xì)胞的熒光值會(huì)持續(xù)增加。繼而再加入篩選藥物,通過6小時(shí)的處理后,測定熒光值,通過熒光值的改變可確定通過對(duì)ER作用的抗腫瘤藥物。WB確定藥物確實(shí)對(duì)ER-stress的影響。從篩選的藥物中任一選取一種,流式細(xì)胞術(shù)確定其誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。將表達(dá)錯(cuò)誤折疊蛋白的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細(xì)胞中,同時(shí)加入蛋白合成抑制劑及篩選藥物,WB測定錯(cuò)誤折疊蛋白的表達(dá),以確定藥物可使錯(cuò)誤折疊蛋白被阻斷至ER中,通過加大ER負(fù)荷而導(dǎo)致ER-stress。結(jié)果:運(yùn)用本研究前期建立的熒光細(xì)胞系統(tǒng),篩選出了11種化合物或自然衍生物藥物,其對(duì)于熒光值的影響都≥50%,并且熒光值的改變與藥物的濃度成正相關(guān)。通過WB可確定此11種藥物均可對(duì)ER-stress相關(guān)蛋白產(chǎn)生影響。對(duì)于隨機(jī)選取的藥物CuE,流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果證明CuE確實(shí)可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,并且與濃度也呈正相關(guān)。轉(zhuǎn)染表達(dá)錯(cuò)誤蛋白的質(zhì)粒后WB的結(jié)果證實(shí)被篩選藥物阻斷錯(cuò)誤表達(dá)的蛋白排出ER,以導(dǎo)致ER負(fù)荷加重,且與濃度呈正相關(guān)。結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)建立了一個(gè)方便快捷的系統(tǒng),用以篩選通過誘導(dǎo)ER-stress而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡的藥物。為研究藥物的抗腫瘤機(jī)制提供了簡單的思路和方式。
【圖文】：

（10 μM）、D5（5 μM）和 D5（2 μM）的藥物可以將熒光比值降低 50%，說明本研究所用藥物可能通過阻止內(nèi)質(zhì)網(wǎng) split 綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞漿。

本研究所用藥物可能通過阻止內(nèi)質(zhì)網(wǎng) split 綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞漿。圖 1. 多種藥物可以將熒光比值降低 50%，作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)候選藥物。進(jìn)一步，我們?cè)O(shè)定了其中 10 中藥物進(jìn)行下一步檢測，終濃度初步定為 2 μM。
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R96

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