發(fā)布時間：2019-09-17 15:01

【摘要】：目的:以可分裂的GFP蛋白作為基礎,本研究了建立熒光蛋白系統(tǒng),模擬細胞內(nèi)蛋白降解的途徑。利用此系統(tǒng)篩選了可能對ER產(chǎn)生作用的藥物,并對這些藥物做出基本檢測,確定其確實的抗腫瘤作用。同時通過另外一種檢測方式,來證實此系統(tǒng)篩選藥物的可行性。從而為以后藥物性質(zhì)的檢測提供可行的簡單途徑。方法:利用限制性酶切,我們將可分裂的GFP蛋白S-1端連接在表達錯誤折疊蛋白的質(zhì)粒上,再轉染至細胞,同時將S-10端轉入細胞中,使其在細胞質(zhì)中穩(wěn)定表達。先用蛋白酶抑制劑(MG132)阻斷持續(xù)表達錯誤蛋白的熒光細胞的蛋白降解途徑,細胞的熒光值會持續(xù)增加。繼而再加入篩選藥物,通過6小時的處理后,測定熒光值,通過熒光值的改變可確定通過對ER作用的抗腫瘤藥物。WB確定藥物確實對ER-stress的影響。從篩選的藥物中任一選取一種,流式細胞術確定其誘導腫瘤細胞凋亡。將表達錯誤折疊蛋白的質(zhì)粒轉入細胞中,同時加入蛋白合成抑制劑及篩選藥物,WB測定錯誤折疊蛋白的表達,以確定藥物可使錯誤折疊蛋白被阻斷至ER中,通過加大ER負荷而導致ER-stress。結果:運用本研究前期建立的熒光細胞系統(tǒng),篩選出了11種化合物或自然衍生物藥物,其對于熒光值的影響都≥50%,并且熒光值的改變與藥物的濃度成正相關。通過WB可確定此11種藥物均可對ER-stress相關蛋白產(chǎn)生影響。對于隨機選取的藥物CuE,流式細胞術結果證明CuE確實可誘導細胞凋亡,并且與濃度也呈正相關。轉染表達錯誤蛋白的質(zhì)粒后WB的結果證實被篩選藥物阻斷錯誤表達的蛋白排出ER,以導致ER負荷加重,且與濃度呈正相關。結論:本實驗建立了一個方便快捷的系統(tǒng),用以篩選通過誘導ER-stress而導致腫瘤細胞凋亡的藥物。為研究藥物的抗腫瘤機制提供了簡單的思路和方式。
【圖文】：

（10 μM）、D5（5 μM）和 D5（2 μM）的藥物可以將熒光比值降低 50%，說明本研究所用藥物可能通過阻止內(nèi)質(zhì)網(wǎng) split 綠色熒光蛋白轉運到細胞漿。

本研究所用藥物可能通過阻止內(nèi)質(zhì)網(wǎng) split 綠色熒光蛋白轉運到細胞漿。圖 1. 多種藥物可以將熒光比值降低 50%，作為后續(xù)實驗候選藥物。進一步，我們設定了其中 10 中藥物進行下一步檢測，終濃度初步定為 2 μM。
【學位授予單位】：安徽醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R96

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