【摘要】：目的:1.對比研究單用PI3K抑制劑BKM120對乳腺癌化療藥物敏感細(xì)胞系和耐藥細(xì)胞系間的差異作用,了解BKM120對乳腺癌化療耐藥細(xì)胞體內(nèi)、體外的抑制作用,并進(jìn)一步探討其對耐藥細(xì)胞發(fā)揮抗癌作用的作用機(jī)制。2.在體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)中聯(lián)合應(yīng)用PI3K抑制劑BKM120及化療藥物阿霉素,以研究BKM120聯(lián)合常規(guī)化學(xué)治療藥物對乳腺癌化療耐藥細(xì)胞體內(nèi)、體外的抑制作用及其潛在的機(jī)制。方法:1.利用MTT方法,比較BKM120和常見化療藥物對乳腺癌化療藥物敏感細(xì)胞系和耐藥細(xì)胞系間的差異作用,并通過Annexin V/P染色法,Caspase-3/7活性檢測以及Caspase-9檢測法等方法檢測BKM120對目標(biāo)細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用,同時(shí)使用實(shí)時(shí)定量PCR法檢測凋亡相關(guān)基因的mRNA水平改變;在機(jī)制研究中,采用Western-blotting檢測了PI3K/AKT/NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路活性的改變,免疫熒光實(shí)驗(yàn)明確了NF-κB p65亞基在BKM120作用后的總體表達(dá)量及定位的改變情況。分別以ALDH及CD44+/CD24-為乳腺癌干細(xì)胞標(biāo)志物,利用流式細(xì)胞儀檢測乳腺癌敏感細(xì)胞系及耐藥細(xì)胞系中干細(xì)胞比例,同時(shí)對比BKM120單藥治療前后干細(xì)胞比例的改變。同時(shí)利用球囊培養(yǎng)技術(shù)及軟瓊脂克隆形成技術(shù)檢測BKM120對不同細(xì)胞系的干細(xì)胞體外成瘤能力的影響。構(gòu)建乳腺癌耐藥細(xì)胞株的體外移植瘤小鼠模型,將小鼠隨機(jī)分為對照組、BKM120組,檢測BKM120單藥對于乳腺癌耐藥細(xì)胞系的體內(nèi)抑制作用。2.采用MTT方法檢測BKM120與阿霉素兩藥聯(lián)合對于乳腺癌敏感細(xì)胞系級耐藥細(xì)胞系中的作用,通過CalcuSyn軟件,進(jìn)行ChouTalalay法檢測聯(lián)合指數(shù)(combination index,CI)以明確BKM120與阿霉素兩藥之間的聯(lián)合作用方式。構(gòu)建乳腺癌耐藥細(xì)胞株的體外移植瘤小鼠模型,將小鼠隨機(jī)分為BKM120單藥組、阿霉素單藥組以及兩藥聯(lián)合組,檢測BKM120與阿霉素聯(lián)合應(yīng)用對乳腺癌耐藥細(xì)胞系的體內(nèi)移植瘤的抑制作用。結(jié)果:1.在以乳腺癌MDR細(xì)胞系MCF-7/A02和CalDOX,以及其對應(yīng)敏感細(xì)胞系MCF-7和Cal51為研究對象的MTT實(shí)驗(yàn)中,發(fā)現(xiàn)BKM120對于敏感細(xì)胞系及耐藥細(xì)胞系均存在抑制作用,且呈濃度依賴性,二者之間ic50僅存在1.2-6.8倍的差異,遠(yuǎn)小于常規(guī)化療藥物敏感和耐藥細(xì)胞系ic50間的差異�？寺⌒纬蓪�(shí)驗(yàn)檢測bkm120對上述細(xì)胞系的長期抑制作用發(fā)現(xiàn):bkm120可長期抑制耐藥細(xì)胞系的生長能力。2.分別通過annexinv/propidium染色法,caspase-3/7活性檢測以及caspase-9檢測法等3種方法檢測bkm120對敏感細(xì)胞系及耐藥細(xì)胞系的凋亡誘導(dǎo)作用,發(fā)現(xiàn)bkm120對耐藥細(xì)胞系仍存在誘導(dǎo)凋亡的作用。在發(fā)生凋亡的機(jī)制研究中發(fā)現(xiàn)bkm120作用于耐藥細(xì)胞系后,mrna水平上,survivin的mrna轉(zhuǎn)錄水平顯著下調(diào),而bim和bax顯著上調(diào),在蛋白水平,bkm120可有效抑制pi3k/akt通路活性,且nf-κbp64亞基在總蛋白和核蛋白的表達(dá)均有所降低。3.在bkm120單藥對耐藥細(xì)胞中干細(xì)胞亞群的作用分析發(fā)現(xiàn),耐藥細(xì)胞系中cd44+/cd24-細(xì)胞和aldh+細(xì)胞的比例均顯著增加。當(dāng)bkm120分別作用于mcf-7/a02和caldox細(xì)胞時(shí),cd44+/cd24-細(xì)胞和aldh+細(xì)胞的比例均有所下降,且呈濃度依賴性。進(jìn)一步研究bkm120對干細(xì)胞體外成瘤能力影響發(fā)現(xiàn),bkm120作用后,耐藥細(xì)胞系mcf-7/a02和caldox的球囊形成能力及克隆形成能力均顯著下降。4.分別構(gòu)建mcf-7/a02和caldox細(xì)胞體外移植瘤裸鼠模型,可見與體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致,裸鼠在可耐受bkm120單藥治療的同時(shí),bkm120可有效抑制移植瘤的增長,且可降低移植瘤中pakt蛋白及細(xì)胞核內(nèi)nf-κbp64亞基的表達(dá)。5.bkm120聯(lián)合阿霉素分別作用于敏感細(xì)胞系和對應(yīng)的耐藥細(xì)胞系的研究中可見,bkm120與阿霉素在耐藥細(xì)胞系中的協(xié)同作用更為顯著,而在敏感細(xì)胞系中兩藥聯(lián)合的協(xié)同作用較弱。在體外移植瘤模型中的結(jié)果與體外研究結(jié)果一致:兩藥聯(lián)合對體內(nèi)移植瘤的抑制作用得到了顯著增加。結(jié)論:1.在體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)中,pi3k抑制劑bkm120可有效抑制乳腺癌耐藥細(xì)胞系的生長增殖及成瘤能力,其發(fā)揮作用的機(jī)制可能存在以下2種:bkm120可通過抑制pi3k/akt/nf-κb信號通路活性,抑制nf-κb入核,從而誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡;bkm120可有效抑制耐藥細(xì)胞系中乳腺癌干細(xì)胞的比例,從而發(fā)揮對耐藥細(xì)胞生長增殖及成瘤能力的抑制作用。2.在針對耐藥細(xì)胞的體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果均證實(shí)PI3K抑制劑BKM120與常規(guī)化療藥物阿霉素兩藥間存在協(xié)同作用。
【圖文】：

圖 1.1 BKM120 對乳腺癌敏感細(xì)胞與耐藥細(xì)胞的生長抑制作用為了進(jìn)一步研究 BKM120 對敏感及耐藥細(xì)胞系的長期作用，我們利用平板克隆形成實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了檢測。與預(yù)想中得結(jié)果一樣，相同藥物濃度下，阿霉素對耐藥細(xì)胞系生長的抑制作用較敏感細(xì)胞系顯著降低。在作用 1 周后，BKM120顯著降低了耐藥細(xì)胞的生長能力(圖1.2)�？梢�，對于對傳統(tǒng)化療藥物耐藥的MDR細(xì)胞系而言，BKM120 可有效抑制其生長。

圖 1.1 BKM120 對乳腺癌敏感細(xì)胞與耐藥細(xì)胞的生長抑制作用為了進(jìn)一步研究 BKM120 對敏感及耐藥細(xì)胞系的長期作用，我們利用平板克隆形成實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了檢測。與預(yù)想中得結(jié)果一樣，，相同藥物濃度下，阿霉素對耐藥細(xì)胞系生長的抑制作用較敏感細(xì)胞系顯著降低。在作用 1 周后，BKM120顯著降低了耐藥細(xì)胞的生長能力(圖1.2)�？梢�，對于對傳統(tǒng)化療藥物耐藥的MDR細(xì)胞系而言，BKM120 可有效抑制其生長。
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R96

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