【摘要】：多重耐藥性金黃色葡萄球菌(Methicillin—resistant Staphylococcus aureus,MRSA)是一種遍布全球的高致死病原菌,被稱為“超級(jí)細(xì)菌”,目前MRSA感染已經(jīng)超過艾滋病(HIV)、結(jié)核病和病毒性肝炎成為患者首位致死原因,嚴(yán)重威脅公共衛(wèi)生安全。MRSA對(duì)常見抗菌藥物耐藥現(xiàn)象嚴(yán)重,臨床使用的首選藥物萬古霉素也已分離出耐藥菌株,給臨床用藥帶來了巨大的困難。尋求能夠有效替代萬古霉素的抗MRSA先導(dǎo)化合物,開發(fā)治療MRSA感染的新型抗菌藥物具有重大意義。本課題以MRSA為指示菌篩選出一株高產(chǎn)生物活性物質(zhì)的芽孢桿菌,在對(duì)其發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化化后,系統(tǒng)研究了發(fā)酵液中抗MRSA有效成分的分離方法、結(jié)構(gòu)鑒定、體外活性評(píng)價(jià)及其含量測(cè)定。獲得如下成果:1.從45株芽孢桿菌中篩選出一株對(duì)MRSA具有較強(qiáng)抑制作用且穩(wěn)定性好的菌株SC-2,通過對(duì)其形態(tài)觀察、生理生化特征及16S rDNA序列的測(cè)定,鑒定該菌株為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)。2.優(yōu)化出菌株SC-2的發(fā)酵培養(yǎng)基:C6H12O6 2.0%、黃豆粉0.5%、CaCO3 0.05%,pH7.0;菌株SC-2產(chǎn)抗MRSA活性物質(zhì)的種子液培養(yǎng)條件:溫度36℃、接種量5%(V/V)、裝液量1000mL/2000m L瓶、時(shí)間16h;50L發(fā)酵罐參數(shù):溫度36℃、接種量5%(V/V)、轉(zhuǎn)數(shù)150 r/min,通氣量1.5 m3/h,罐壓0.05MPa,裝液量25L;700L發(fā)酵工藝:溫度36℃、接種量7%(V/V)、轉(zhuǎn)數(shù)150 r/min,通氣量21 m3/h,罐壓0.05MPa,裝液量350L。3.菌株SC-2發(fā)酵液抗MRSA活性提取物的制備工藝:采用納濾膜濃縮初步確定了SC-2發(fā)酵液中主要活性成分的分子量(200-1000);篩選出HP20大孔吸附樹脂對(duì)SC-2膜濃縮液進(jìn)行脫色,參數(shù)為:上樣量7BV,吸附流速2BV/h,再生溶劑為50%乙醇鹽酸溶液(2%HCI);篩選出AmberliteXAD16N大孔吸附樹脂提取菌株SC-2所產(chǎn)活性物質(zhì)的工藝參數(shù):吸附量3.5BV,吸附流速為1BV/h,洗脫溶劑為20%乙醇溶液,洗脫體積3.5BV,洗脫流速1BV/h;最后用75%乙醇沉淀去除雜質(zhì)。整個(gè)工藝簡(jiǎn)單,去雜率達(dá)到80%,最終粗提物的抗菌活性與同濃度的萬古霉素相當(dāng)。4.采用硅膠柱層析梯度洗脫收集活性組分,然后經(jīng)過Sephadex G-10過濾,最終利用HPLC制備得到一肽類抗MRSA活性成分G2-Ⅱ,純度大于95%。化合物G2-Ⅱ通過質(zhì)譜、氨基酸N端測(cè)序、氨基酸組成分析,并與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道產(chǎn)物比較,初步確定該化合物是由Ala-Lys-APPA組成的分子量為376.3的三肽化合物,分子式為C14H25N4O6P。5.建立了HPLC法測(cè)定發(fā)酵液中活性化合物G2-Ⅱ含量的方法,色譜條件:Welchrom LP-C18(250mm×4.6mm,5um),流動(dòng)相甲醇-水(1:99→3:97,0-30min),流速0.8 mL/min,檢測(cè)波長204nm,進(jìn)樣量10u L,柱溫為25℃。結(jié)果顯示,化合物G2-Ⅱ在5.0μg~25.0μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,回歸方程為Y=2E+06x+870660,r=0.9996;采用該方法測(cè)定出菌株SC-2發(fā)酵液中活性化合物G2-Ⅱ的含量約為0.90~0.93mg/L。6.化合物G2-Ⅱ?qū)δ退幗瘘S色葡萄球菌、耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌、痤瘡丙酸桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌、幽門螺桿菌、白色念珠菌、馬拉色菌等常見致病菌都具有良好的拮抗作用,其抗菌譜較廣。G2-Ⅱ?qū)RSA的MIC值為8μg/m L,優(yōu)于萬古霉素的16μg/m L;化合物G2-Ⅱ在濃度為32μg/m L-3mg/m L之間對(duì)多重耐藥性金黃色葡萄球菌的抗菌活性隨著藥品濃度的增加而提高,并且在各濃度的抑菌活性都明顯優(yōu)于陽性藥物萬古霉素。
【圖文】：

圖 1.3 其它非核糖體途徑合成產(chǎn)物的分子結(jié)構(gòu)Fig. 1.3. Chemical structures of other non-ribosomally synthesized products. (A) Bacilysinrhizocticin; (C G) amicoumacins; (H J) L-Pro- L -Leu, D -Pro- L - LD -Pro- L Tyr.圖 1.3 其它非核糖體途徑合成產(chǎn)物的分子結(jié)構(gòu)Fig. 1.3. Chemical structures of other non-ribosomally synthesized products. (K) mycobaciand (L) TL-119.

11圖 1.3 其它非核糖體途徑合成產(chǎn)物的分子結(jié)構(gòu)Fig. 1.3. Chemical structures of other non-ribosomally synthesized products. (K) mycobacillinand (L) TL-119.1.3.2 核糖體途徑合成的產(chǎn)物芽孢桿菌的代謝產(chǎn)物中有些生物活性物質(zhì)是通過基因編碼或者核糖體合成途徑產(chǎn)生的，主要包括羊毛硫抗生素和一些抗真菌的蛋白，包括 Subtilin，ericin S，ericA，sublancin，revised sublancin,subtilosinA,mersacidin,Ab in-dicates α-amin -obutyri,Δindicates a 2,3-didehydroalan -ine and ΔB indicates 2,3-didehyd robutyrin -e[67,73].1.3.3. 非肽類抗菌活性物質(zhì)芽孢桿菌代謝產(chǎn)生的非肽類抗菌活性物質(zhì)較多，部分化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖 1.4，，根據(jù)其結(jié)構(gòu)大致可分為：①聚酮類化合物：芽孢桿菌可產(chǎn)生多種具有生物活性的聚酮類化合物，如
【學(xué)位授予單位】：重慶理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R915

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2529651