【摘要】：目的建立一種檢測微量脆弱擬桿菌(Bacteroides fragilis)來源的α-半乳糖苷酶的方法用于測定酶解轉(zhuǎn)變的通用型紅細胞上的殘留酶。方法用脆弱擬桿菌來源的基因重組α-半乳糖苷酶(純度大于90%)免疫BALB/c小鼠,制備單抗;用穩(wěn)定分泌抗體的雜交瘤細胞株制備腹水單抗,再經(jīng)HiT rap rP rotein A柱純化獲得高純度的抗體;間接ELISA法測定單抗效價,Western印跡法評價單抗特異性。聯(lián)合純化后的單抗和兔多抗采用間接ELISA法檢測酶解法制備的通用型紅細胞和洗滌液中的殘留酶量。結(jié)果獲得了高效價高純度的單抗,Western印跡實驗顯示該抗體可特異性地與新型α-半乳糖苷酶結(jié)合;間接ELISA法檢測微量α-半乳糖苷酶的下限為1 ng/ml,紅細胞按1∶4的體積比經(jīng)4次洗滌后,其殘留酶量10 ng/ml。結(jié)論所建立的在血型轉(zhuǎn)變過程中檢測微量殘留α-半乳糖苷酶的方法,可用于酶解法制備的通用型紅細胞的安全性評價。
【圖文】：

到1株能穩(wěn)定分泌α-半乳糖苷酶的單抗的雜交瘤細胞株B7G11。按照常規(guī)秋水仙堿阻斷法處理。結(jié)果顯示雜交瘤細胞有96條染色體，接近小鼠脾細胞染色體(40條)和SP2/0細胞染色體(平均60條左右)之和，證明篩選的細胞為小鼠脾細胞和SP2/0的雜交瘤細胞。經(jīng)單抗類型及亞型檢測試劑盒檢測鑒定該雜交瘤單抗的亞型為IgG1型。2．3腹水單抗的純化及特異性鑒定腹水單抗經(jīng)HiTraprProteinA柱純化后，通過還原SDS-PAGE可以看到純化后的抗體為2條帶，分別是抗體的重鏈和輕鏈，通過非還原SDS-PAGE檢測，可以看到純化后的抗體呈單一條帶(圖1)。腹水單抗的蛋白濃度是50．7mg/ml，純化后的樣品的蛋白濃度為0．78mg/ml，效價為1∶1×105。用表達脆弱擬桿菌來源的α-半乳糖苷酶的重組菌的全菌體蛋白進行Western印跡實驗，可見在60×103左右處有明顯條帶，說明腹水單抗特異與α-半乳糖苷酶結(jié)合(圖2)。2．4殘留酶檢測采用四參數(shù)Logistic模型繪制標準曲線(圖3)，公式如下:y=(A－D)/［1+(x/C)B］+D式中，A=1．56653，B=－1．43640，C=45．08542，D=0．35376，r2=0．99863。本方法的檢測下限為1ng/ml，將待測樣品平均值代入公式即得出待測樣圖1脆弱擬桿菌來源的α-半乳糖苷酶單抗純化的還原型(A)和非還原型(B)SDS-PAGE圖譜M．蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標準;1．上樣液;2．上樣流出液;3．洗脫液圖2脆弱擬桿菌來源的α-半乳糖苷酶單抗特異性的Western印跡鑒定M．蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標準;1．重組菌全菌體蛋白品的殘留酶量。洗滌液及紅細胞上的殘留酶量見表1。酶解后的紅細胞經(jīng)4次洗滌后未能檢測到酶的殘留，表明第4次洗滌后的紅細胞上的殘留酶量＜10ng/ml，由此確定酶解紅細胞的洗滌次數(shù)為4次。圖3微量α-半乳糖苷酶檢測的標準曲線表1通用型

觳饈約梁屑觳餳釯ǜ迷詠?瘤單抗的亞型為IgG1型。2．3腹水單抗的純化及特異性鑒定腹水單抗經(jīng)HiTraprProteinA柱純化后，通過還原SDS-PAGE可以看到純化后的抗體為2條帶，分別是抗體的重鏈和輕鏈，通過非還原SDS-PAGE檢測，可以看到純化后的抗體呈單一條帶(圖1)。腹水單抗的蛋白濃度是50．7mg/ml，純化后的樣品的蛋白濃度為0．78mg/ml，效價為1∶1×105。用表達脆弱擬桿菌來源的α-半乳糖苷酶的重組菌的全菌體蛋白進行Western印跡實驗，可見在60×103左右處有明顯條帶，說明腹水單抗特異與α-半乳糖苷酶結(jié)合(圖2)。2．4殘留酶檢測采用四參數(shù)Logistic模型繪制標準曲線(圖3)，公式如下:y=(A－D)/［1+(x/C)B］+D式中，A=1．56653，B=－1．43640，C=45．08542，D=0．35376，r2=0．99863。本方法的檢測下限為1ng/ml，，將待測樣品平均值代入公式即得出待測樣圖1脆弱擬桿菌來源的α-半乳糖苷酶單抗純化的還原型(A)和非還原型(B)SDS-PAGE圖譜M．蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標準;1．上樣液;2．上樣流出液;3．洗脫液圖2脆弱擬桿菌來源的α-半乳糖苷酶單抗特異性的Western印跡鑒定M．蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標準;1．重組菌全菌體蛋白品的殘留酶量。洗滌液及紅細胞上的殘留酶量見表1。酶解后的紅細胞經(jīng)4次洗滌后未能檢測到酶的殘留，表明第4次洗滌后的紅細胞上的殘留酶量＜10ng/ml，由此確定酶解紅細胞的洗滌次數(shù)為4次。圖3微量α-半乳糖苷酶檢測的標準曲線表1通用型紅細胞制備過程中殘留α-半乳糖苷酶的檢測檢測項目α-半乳糖苷酶含量(ρB/ng·ml－1)紅細胞洗滌液上清第1次909．9±73．6第2次132．1±31．5第3次4．7±0．5第4次3．6±1．6第4次洗滌后紅細胞－－:未測出，低于檢測下限304軍事醫(yī)學2015年4月第39?
【作者單位】： 軍事醫(yī)學科學院野戰(zhàn)輸血研究所;
【基金】：國家自然科學基金資助項目(81300447)
【分類號】：R943

【參考文獻】

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【二級參考文獻】

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9 高紅偉;宮鋒;王璇琳;徐莉娟;由英;王穎麗;田曙光;章?lián)P培;;α-半乳糖苷酶活性測定方法的研究[J];軍事醫(yī)學科學院院刊;2006年06期

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本文編號：2529410