【摘要】：目的：干擾素（interferon，IFN）是目前慢性乙型病毒性肝炎（ChronicHepatitis B，CHB）和慢性丙型病毒性肝炎（Chronic Hepatitis C，CHC）抗病毒治療過程中一個重要的組成部分。在抗乙型肝炎病毒藥物中，IFN與核苷（酸）類似物相比具有療程短、停換藥方便等優(yōu)勢；在慢性丙型病毒肝炎治療中，IFN聯(lián)合利巴韋林還是其標準治療方案。雖然目前已有數(shù)十種干擾素被發(fā)現(xiàn)，然而在中國僅有隸屬于Ⅰ型干擾素的IFN-α應用到病毒性肝炎的抗病毒治療中。但是，在此治療過程中僅有30%-40%CHB患者能達到e抗原的血清學轉(zhuǎn)換，約有60%的患者對其治療應答不佳；而且有50%-60%的基因1型CHC患者無法得到持續(xù)病毒學應答（SustainedVirological Response，SVR）。與此同時，由于IFN-α的諸多副作用，部分患者在治療過程中還因為嚴重的副反應而終止治療。近期研究發(fā)現(xiàn)泛素特異性蛋白酶18（Ubiquitin-specific protease18，USP18）是IFN-α療效的重要影響因子，并且進一步研究證實USP18是IFN-α治療效果的重要負性調(diào)節(jié)因子。IFN-λ是最新發(fā)現(xiàn)的一類新型干擾素，隸屬于Ⅲ型干擾素；與IFN-α類似它也是通過激活JAK-STAT（Janus activated kinase-signal transducerand activator of transcription，JAK-STAT）通路并調(diào)控一系列抗病毒蛋白如：雙鏈RNA依賴的蛋白激酶R（PKR)和抗黏病毒蛋白（mixovirus resistanceprotein A，MxA）來發(fā)揮抗病毒作用。最新體外研究發(fā)現(xiàn)在IFN-α應答不佳的細胞中IFN-λ仍然可以發(fā)揮抗病毒作用。關于USP18在IFN-α的抗病毒通路中的研究進展很多，但對于其在IFN-λ的抗病毒信號轉(zhuǎn)導通路中的影響報道甚少。本研究旨在探討USP18對IFN-α和IFN-λ抗病毒信號通路的不同影響及其臨床意義。 方法：復蘇Huh-7細胞用含10%胎牛血清、1%青鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基在5%CO2，37℃條件下培養(yǎng)至對數(shù)生長期，然后分為空白對照組、IFN-α實驗組和IFN-λ實驗組。 1IFN-α實驗組給予IFN-α2a（20IU/ml），IFN-λ實驗組給予IFN-λ1（10ng/ml）進行刺激，空白對照組常規(guī)培養(yǎng)并加入等體積無菌生理鹽水，分別于6h，12h，24h，，48h后收細胞。 2空白對照組常規(guī)培養(yǎng)并加入無菌生理鹽水，IFN-α實驗組給予IFN-α2a（20IU/ml），IFN-λ實驗組給予IFN-λ1（10ng/ml）進行刺激12小時，然后三組細胞用預冷的PBS緩沖液漂洗三遍后重新置入新鮮的無干擾素培養(yǎng)基中培養(yǎng)16h，然后分別再次給予無菌生理鹽水、IFN-α2a（20IU/ml）和IFN-λ1（10ng/ml）刺激12h后收細胞。 3空白對照組常規(guī)培養(yǎng)并加入無菌生理鹽水，IFN-α實驗組給予IFN-α2a（20IU/ml），IFN-λ實驗組給予IFN-λ1（10ng/ml）進行刺激12小時，然后三組細胞用預冷的PBS緩沖液漂洗三遍后重新置入新鮮的無干擾素培養(yǎng)基中培養(yǎng)16h，然后再分別給予無菌生理鹽水、IFN-λ1（10ng/ml）和IFN-α2a（20IU/ml）刺激12h后收細胞。 實時熒光定量聚合酶連反應（Real Time-quantitative Polymerase ChainReaction, RT-qPCR）法檢測Huh-7細胞USP18、STAT1、PKR和MxA的mRNA表達水平。Western-blot檢測USP18、P-STAT1、STAT1、PKR及MxA的蛋白表達水平。 結(jié)果： 1不同干擾素刺激時間（6h，12h，24h，48h）各組Huh-7細胞指標的變化： 1.1各組細胞USP18的表達變化： 隨著干擾素刺激時間的延長，IFN-α實驗組和IFN-λ實驗組Huh-7細胞內(nèi)USP18mRNA的表達增加，但IFN-α組比IFN-λ組增加更為明顯且在24h、48h USP18mRNA的表達明顯高于IFN-λ組（5.33±0.47VS4.60±0.42，5.41±0.46VS4.76±0.78），差異有統(tǒng)計學意義（P0.01）。此外，IFN-α組和IFN-λ組細胞的USP18mRNA均高于空白對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P0.01）。隨著干擾素刺激時間的延長，IFN-α組和IFN-λ組Huh-7細胞內(nèi)USP18蛋白的表達也開始增加，IFN-α組比IFN-λ組增加更明顯且在48h時USP18蛋白的升高明顯大于IFN-λ組（1.61±0.04VS1.46±0.03），差異有統(tǒng)計學意義（P0.05）。 1.2不同刺激時間各組細胞STAT1、PKR和MxA的表達變化以及STAT1磷酸化蛋白的變化： 1.2.1隨著干擾素刺激時間的延長，IFN-α組和IFN-λ組Huh-7細胞內(nèi)STAT1、PKR和MxA mRNA表達呈現(xiàn)上升趨勢，并且在刺激12h時IFN-α組STAT1、PKR和MxA mRNA表達水平達到最高，且明顯高于IFN-λ組（5.61±0.44VS4.84±0.33，5.42±0.37VS4.68±0.15，3.82±0.35VS3.23±0.46），差異有統(tǒng)計學意義（P值均0.01）。隨后，IFN-α組的STAT1、PKR和MxA mRNA表達水平呈現(xiàn)降低趨勢，而IFN-λ組的表達繼續(xù)上升并在24h時達到高峰，并且高于IFN-α組（5.30±0.15VS5.95±0.37，4.81±0.43VS5.81±0.40，3.37±0.46VS4.63±0.62），差異有統(tǒng)計學意義（P值均0.01）。此后兩組的STAT1、PKR和MxA mRNA表達開始下降，但48h IFN-λ組仍高于IFN-α組。各組Huh-7細胞STAT1、PKR和MxA蛋白水平變化與mRNA表達變化類似。 1.2.2隨著干擾素刺激時間的延長，IFN-α組和IFN-λ組Huh-7細胞內(nèi)STAT1磷酸化蛋白的表達呈現(xiàn)上升趨勢。IFN-α組的STAT1磷酸化蛋白表達水平高于IFN-λ組，并且在刺激12h時IFN-α組STAT1磷酸化蛋白表達水平達到最高，且明顯高于IFN-λ組（1.19±0.02VS0.63±0.02），差異有統(tǒng)計學意義（P0.05）。隨后，IFN-α組STAT1磷酸化蛋白表達開始下降，IFN-λ組的表達繼續(xù)上升并在24h時達到高峰，并且高于IFN-α組（0.71±0.01VS1.25±0.02），差異有統(tǒng)計學意義（P0.05）。 2三組細胞分別給予無菌生理鹽水、IFN-α2a（20IU/ml）、IFN-λ1（10ng/ml）進行刺激12h后更換無干擾素的新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)16h后再次給予無菌生理鹽水、IFN-α2a（20IU/ml）、IFN-λ1（10ng/ml）刺激12h后細胞各個指標的變化。 2.1各指標mRNA表達的變化： IFN-α組的USP18mRNA表達高于IFN-λ組（4.04±0.39VS3.25±0.26），差異有統(tǒng)計學意義（P0.05）。IFN-α組STAT1、PKR、MxA的mRNA表達均低于IFN-λ組（4.71±0.28VS6.54±0.26，3.71±0.25VS5.41±0.32，2.91±0.23VS4.31±0.19），差異有統(tǒng)計學意義（P值均0.05）。 2.2各指標蛋白表達水平的變化： IFN-α組的USP18蛋白表達高于IFN-λ組（1.93±0.15VS1.82±0.14），差異有統(tǒng)計學意義（P0.05）。IFN-α組STAT1、P-STAT1、PKR、MxA的蛋白表達均低于IFN-λ組分別為（1.13±0.16VS1.61±0.17，1.12±0.18VS1.49±0.15，1.31±0.13VS1.91±0.16，1.09±0.19VS1.59±0.10），差異有統(tǒng)計學意義（P值均0.05）。 3三組細胞分別給予無菌生理鹽水、IFN-α2a（20IU/ml）、IFN-λ1（10ng/ml）進行刺激12h后更換無干擾素的新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)16h后再給予無菌生理鹽水、IFN-λ1（10ng/ml）、IFN-α2a（20IU/ml）刺激12h后細胞各個指標的變化。 3.1各指標mRNA表達的變化： IFN-α組的USP18mRNA表達與IFN-λ組（3.54±0.28VS3.46±0.31）相比差異無統(tǒng)計學意義（P0.05）。IFN-α組STAT1、PKR和MxA的mRNA表達低于IFN-λ組（5.69±0.22VS5.81±0.33，4.31±0.20VS4.76±0.26，3.49±0.27VS3.80±0.20），差異有統(tǒng)計學意義（P值均0.05）。 3.2各指標蛋白表達水平的變化： IFN-α組USP18蛋白表達低于IFN-λ組（1.76±0.16VS1.90±0.12），差異有統(tǒng)計學意義（P0.05）。兩組細胞P-STAT1表達無差異（1.29±0.15VS1.30±0.19，P0.05）。IFN-α組PKR、MxA蛋白表達低于IFN-λ組（1.40±0.10VS1.49±0.14，1.23±0.11VS1.42±0.14），差異有統(tǒng)計學意義（P值均0.05）。 結(jié)論： 1在Huh-7細胞內(nèi)IFN-λ的抗病毒信號轉(zhuǎn)導不受USP18的影響。 2在對IFN-α刺激不敏感的Hun-7細胞中IFN-λ仍能激活抗病毒信號通路，促進抗病毒蛋白的生成。 3IFN-α刺激Huh-7細胞后抗病毒蛋白生成迅速，但消退速度也快；而IFN-λ刺激后抗病毒蛋白的生成相對緩慢，但持續(xù)的時間更加的持久。 4重復使用IFN-α刺激Huh-7細胞后USP18水平明顯升高，抗病毒蛋白生成減少。 5重復使用IFN-λ刺激Huh-7細胞USP18的升高不明顯，抗病毒蛋白生成未見減少。
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R978.7

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本文編號：2524915