【摘要】：美登素類化合物(maytansinoids)是一類以3-氨基-5-羥基苯甲酸(AHBA)為起始單元,由Ⅰ型聚酮合酶(polyketide synthase,PKS)合成的19元大環(huán)內(nèi)酰胺類安莎霉素,具有很好的抗菌和抗腫瘤活性。基于美登素的抗體偶聯(lián)藥物ado trastuzumab entansine(商品名Kadcyla)已經(jīng)被批準用于HER2陽性轉(zhuǎn)移性乳腺癌的治療,此外,尚有10余種偶聯(lián)該類毒素的抗體偶聯(lián)藥物正處于臨床研究階段。美登素類抗體偶聯(lián)藥物合成的核心前體美登醇(maytansinol)目前是由微生物發(fā)酵得到的安絲菌素類(ansamitocins)在體外經(jīng)半合成制備而成,但該方法存在成本高、產(chǎn)率低、副產(chǎn)物不易分離除去等缺點,不利于美登素類抗體偶聯(lián)藥物的研究和生產(chǎn)。因此,尋找新的美登醇替代來源具有重要意義。前期,本實驗室從白色擬無枝酸菌Amycolatopsis alba DSM44262中分離鑒定了 5個美登素衍生物ansacarbamitocins(1-5)。我們通過對DSM44262菌株基因組序列的生物信息學分析,定位了 ansacarbamitocins的合成基因簇abm。通過與已報道的安絲菌素合成基因簇比較,發(fā)現(xiàn)abm基因簇含有2個氨甲酰基轉(zhuǎn)移酶基因abm2la和abm2lb,及1個N-糖基轉(zhuǎn)移酶的基因abm25,推測它們可能分別負責ansacarbamitocins C3和C7位羥基的氨甲�；�,及ansacarbamitocins的N-糖基化。因此,有望通過敲除負責C3位羥基氨甲酰化的基因及abm25獲得美登醇類似物。為此,我們首先建立了A.alba DSM44262的菌絲體電轉(zhuǎn)化遺傳操作體系;然后分別對abm2la和abm2lb和abm25進行了體內(nèi)敲除。通過對abm2la和abm2lb敲除突變株積累中間產(chǎn)物的分離鑒定,發(fā)現(xiàn)2株敲除突變株積累的中間產(chǎn)物相同,即積累了 大量的 19-chloroproansamitocin 和少量的 14-OH-19-chloroproansamitocin,從而推測abm2la和abm2lb可能共同參與ansacarbamitocins中C3和C7位羥基的氨甲�；Ｍㄟ^對abm25敲除突變株積累中間產(chǎn)物的分離鑒定,獲得了N-deglucosyl-ansacarbamitocinA,表明abm2 參與了 ansacarbamitocins 的 N-糖基化。此外,由于抗生素類N-糖基轉(zhuǎn)移酶難以獲得可溶性重組蛋白,限制了其體外功能研究,因此,我們開展了 abm25的體外研究。對abm25基因進行了系統(tǒng)的異源表達條件摸索,最終獲得了可溶且有活性的His-SUMO-Abm25融合蛋白,這是首次獲得的可溶且有活性的N-糖基轉(zhuǎn)移酶。通過測定不同pH值和溫度對Abm25酶活的影響,發(fā)現(xiàn)Abm25的最適pH為8.0,最適反應溫度為37℃。接著,我們進一步測定了 Abm25的動力學參數(shù),在UDP-葡萄糖500 μM的條件下,19-chloroproansamitocin 對應的 為 2.44士0.26 μM,kcat 為 0.24±0.01 min-1;在19-chloroproansamitocin400 μM 的條件下,UDP-Glc 對應的Km為 10.22±1.36 μM,kcat為0.15±0.01 min-1。與此同時,還開展了 Abm25的底物廣譜性研究,發(fā)現(xiàn)Abm25對于糖受體具有嚴格的專一性,糖供體除UDP-葡萄糖外還可利用UDP-葡萄糖醛酸,豐富了抗生素類N-糖基轉(zhuǎn)移酶工具酶庫。本研究鑒定了白色擬無枝酸菌DSM44262中的ansacarbamitocins合成基因簇,主要對其后修飾過程中的氨甲�；D(zhuǎn)移酶基因abm21a與abm21b和N-糖基化酶abm25進行了研究。進一步的工作可以在DSM44262的abm21a/abm21b及abm25敲除突變株基礎上回補來源于安絲菌素基因簇的asm21基因(Asm21可催化19-chloroproansamitocin中C7位羥基的氨甲酰化),以期構建美登醇類似物產(chǎn)生菌株,為進一步的美登素類抗體偶聯(lián)藥物研究奠定基礎。
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R915

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本文編號：2522200