【摘要】：目的： 合成多肽偶聯(lián)殼聚糖，制備多肽偶聯(lián)殼聚糖川芎嗪納米粒（多肽殼聚糖納米粒， pEGF-CS-TMP-NPs），研究其體外靶向性與靶向分布機制。 方法： 1.氧化降解法制備低分子量殼聚糖。烏氏粘度計測定不同濃度過氧化氫、不同降解時間下殼聚糖的特性黏度，Mark-Houwink方程計算殼聚糖分子量。分析殼聚糖降解前后紅外光譜結(jié)構(gòu)表征。 2.以2-亞氨基硫烷鹽酸鹽為偶合劑制備巰基殼聚糖，優(yōu)化巰基殼聚糖合成工藝。將表皮生長因子受體（EGFR）特異性配體多肽（pEGF）通過分子內(nèi)二硫鍵修飾于巰基殼聚糖表面合成多肽偶聯(lián)殼聚糖。紅外光譜、核磁共振光譜分析產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)表征。各產(chǎn)物元素含量通過元素分析儀測定。 3.離子交聯(lián)法制備多肽殼聚糖納米粒，透射電鏡觀察多肽殼聚糖納米粒的形態(tài)，激光粒度分析儀測定粒徑、分散度、Zeta電位，高效液相色譜法測定包封率、載藥量。 4.體外恒溫振蕩法模擬體內(nèi)釋藥環(huán)境，對多肽殼聚糖納米粒組、殼聚糖川芎嗪納米粒組（殼聚糖納米粒）、川芎嗪溶液組釋藥情況分別進行考察。pH值為7.4、7.0、6.5，于0.5、1、2、4、6、8、10、12、24、48、96、120h取樣，高效液相色譜法檢測各組藥物濃度，計算各組累計釋放度。 5. MTT法檢測細胞毒作用。選取人肝癌細胞SMMC-7721（EGFR高表達）、人白血病細胞K562（EGFR陰性表達）。分別給予濃度為0.03、0.06、0.12、0.25、0.50、0.62mg mL-1的多肽殼聚糖納米粒和相當載體量的空納米粒，給藥48h，吸光度通過酶標儀檢測。用origin軟件計算兩種細胞、兩種制劑的IC95。 6.多肽殼聚糖納米粒體外靶向分布研究。實驗組SMMC-7721給予無毒劑量的多肽殼聚糖納米粒，對照組SMMC-7721給予相應(yīng)劑量殼聚糖納米粒以及川芎嗪溶液，K562給予相應(yīng)劑量的多肽殼聚糖納米粒。分別作用1、2、4、6、8、10h時取樣，高效液相色譜法檢測細胞內(nèi)川芎嗪濃度。給藥4h，激光共聚焦顯微鏡觀察各組細胞內(nèi)川芎嗪熒光強度。 7.競爭結(jié)合實驗探討多肽殼聚糖納米粒靶向分布機制。選取SMMC-7721與K562細胞，給予無毒劑量的多肽殼聚糖納米粒；對照組選取上述兩種細胞，分別用游離pEGF進行處理，再加入多肽殼聚糖納米粒。作用4h后，各組細胞內(nèi)川芎嗪熒光強度通過激光共聚焦顯微鏡檢測。 結(jié)果： 1.殼聚糖的相對分子質(zhì)量隨降解反應(yīng)時間的延長而降低，且過氧化氫濃度越大降解效率越高。選取3%過氧化氫、降解90min為反應(yīng)條件，得到殼聚糖分子量約為3104作為合成巰基殼聚糖原料。紅外結(jié)果表明降解后殼聚糖結(jié)構(gòu)單元并沒有改變，僅糖苷鍵發(fā)生斷裂。 2.合成巰基殼聚糖。與殼聚糖相比，其紅外圖譜在1621cm-1新出現(xiàn)-C=N的伸縮振動峰。核磁圖譜顯示，巰基殼聚糖在δ2.7、δ1.9處出現(xiàn)新的位移值，說明巰基連接到殼聚糖分子表面。在對巰基殼聚糖工藝優(yōu)化過程中發(fā)現(xiàn)，在pH=6.2時，巰基含量較高，并選擇殼聚糖與2-亞氨基硫烷鹽酸鹽的質(zhì)量比為2:1用于制備巰基殼聚糖。所合成的多肽偶聯(lián)殼聚糖核磁圖譜與殼聚糖相比，δ7.1，δ7.0，δ6.8處新增加三個位移值，分析此為氨基酸中的芳香氫。元素分析結(jié)果顯示，多肽殼聚糖中N、S的含量都有所增加，因此可以判斷pEGF已偶聯(lián)到殼聚糖分子上。 3.HPLC法測得多肽殼聚糖納米粒的包封率為37.660.53%，載藥量為3.240.37%。激光粒度儀測得該納米粒的粒徑為164.37.1nm，分散度(PDI)為0.0530.006，Zeta電位為19.732.18mv。多肽殼聚糖納米粒形態(tài)成圓球形，分布均勻。 4.釋放度結(jié)果顯示多肽殼聚糖納米粒具有緩釋作用，當pH為7.4，釋放時間120h時，累積釋放度達到91%。隨著pH值降低，多肽殼聚糖納米粒累積釋放度升高，在pH6.5條件下，納米粒累積釋放度最高。 5.多肽殼聚糖納米粒對SMMC-7721、K562的0.153mg mL-1、0.253mg mL-1�？占{米粒對兩種細胞的IC95約為0.8mg mL-1。 6.經(jīng)HPLC方法測定，隨著給藥時間的延長，兩種細胞內(nèi)藥物濃度均增加，4h達到飽和。經(jīng)給藥SMMC-7721細胞內(nèi)濃度由高到低依次為多肽殼聚糖納米粒組（37.530.28μg mL-1）、殼聚糖納米粒組（26.670.36μg mL-1）、溶液組（23.510.25μg mL-1）。K562組藥物濃度為25.810.58μg mL-1。多肽殼聚糖納米粒組細胞內(nèi)濃度與其它組相比均有顯著性差異（p0.05）。激光共聚焦顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，實驗組細胞內(nèi)川芎嗪熒光強度顯著高于對照組。 7.激光共聚焦顯微鏡結(jié)果顯示，加入游離pEGF后，SMMC-7721細胞內(nèi)藥物熒光強度顯著降低，K562細胞內(nèi)藥物熒光強度無變化。說明多肽殼聚糖納米粒的靶向機制是通過特異性識別EGFR進入細胞。 結(jié)論： 本實驗合成了新型給藥載體材料多肽偶聯(lián)殼聚糖，制備了理化性質(zhì)穩(wěn)定的多肽殼聚糖川芎嗪納米粒，粒徑小于200nm，，分散均勻并具有緩釋作用。體外實驗表明該制劑對EGFR高表達的人肝癌細胞SMMC-7721具有靶向性，其靶向分布機制可能是通過細胞表面EGFR介導(dǎo)的細胞內(nèi)吞作用實現(xiàn)的。
【圖文】：

大連醫(yī)科大學碩士學位論文巰基殼聚糖的合成巰基殼聚糖的合成反應(yīng)過程如圖 1，取上述方法降解后分子量約 3 104的殼聚糖 0.5g，溶解于25mL 1%的醋酸，得到質(zhì)量分數(shù)為 2%的殼聚糖醋酸溶液，過濾。用 5 mol L-1NaOH調(diào)節(jié)溶液 pH 值 5.8～6.3，在磁力攪拌條件下，分別加入不同濃度的 2-亞氨基硫烷鹽酸鹽(2-Iminothiolane)，30℃避光反應(yīng) 8h，反應(yīng)體系充氮氣。將產(chǎn)物裝入透析袋中，10℃避光透析。5 mol L-1HCl 透析一次，含 1%的 NaCl的同樣介質(zhì)透析兩次，5 mol L-1HCl 透析一次，最后于 1mol L-1HCl 透析一次，每次透析時間均為 24h。-40℃冷凍干燥，4℃保存?zhèn)溆肹13]。2.22.2.1

含川芎嗪濃度 50μg mL，游離 pEGF 濃度為 1μg mL。給藥 4h 后，焦顯微鏡下觀察細胞內(nèi)熒光強度并拍照。學處理組實驗均重復(fù)做 3 次，統(tǒng)計學分析采用 SPSS19.0 軟件進行分析，所得 標準差表示。組間兩兩比較采用最小顯著差異法 t 檢驗（LSD-t）進，p＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。結(jié)果殼聚糖納米粒制備聚糖降解聚糖經(jīng)不同濃度過氧化氫氧化降解后，烏氏粘度計測量結(jié)果如圖 2。由聚糖分子量隨降解反應(yīng)時間的延長而降低，過氧化氫濃度越大降解效取 3%過氧化氫、降解 90min 為條件，得到殼聚糖分子量約為 3 104作殼聚糖原料。
【學位授予單位】：大連醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R943

【參考文獻】

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本文編號：2517578