【摘要】：細(xì)胞凋亡是一種選擇性的細(xì)胞自殺式過程,需要特定的細(xì)胞死亡程序的參與。大量研究表明氧化應(yīng)激是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的重要因素。有研究發(fā)現(xiàn),氧化應(yīng)激狀態(tài)下調(diào)線粒體去乙酰化酶3(Silent mating type information regulation 2 homolog3,Sirt3)的蛋白表達(dá),導(dǎo)致線粒體呼吸鏈關(guān)鍵酶的乙�；皆黾�,活性下降。多亞基的細(xì)胞色素c氧化酶(Cytochrome c oxidase,COX)是線粒體呼吸鏈復(fù)合物IV,在電子傳遞過程中發(fā)揮重要作用。與氧化應(yīng)激密切相關(guān)的老年退行性疾病和缺血/再灌注的細(xì)胞凋亡過程中均發(fā)現(xiàn)COX活性降低。但是目前并不清楚細(xì)胞凋亡是否與COX乙�；癄顟B(tài)升高有關(guān)。據(jù)此,本論文將考察Sirt3與COX乙�；降年P(guān)系,并進(jìn)一步探討其在氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中的作用。首先,本論文研究Sirt3對(duì)COX乙�；接绊憽２捎�30 m M Sirtuin家族抑制劑—尼克酰胺(nicotinic acid amide,NAM)作用于小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(NIH/3T3)3 h后,免疫沉淀(Immunoprecipitation,IP)觀察Sirt3蛋白表達(dá)和COX乙�；阶兓＝Y(jié)果發(fā)現(xiàn)Sirt3蛋白表達(dá)明顯減少,COX乙�；斤@著增加。利用50 n M、100 n M si RNA干擾Sirt3后,利用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)COX的活性,根據(jù)IP分析COX亞基的乙酰化水平改變,WB檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白。結(jié)果也顯示COX活性明顯受到抑制,且COX的各亞基中COX-1乙酰化水平特異性升高,其余各亞基乙�；阶兓幻黠@。此外,Cyt c釋放到胞漿中增加,Caspase 3被激活,引起NIH/3T3細(xì)胞凋亡。上述結(jié)果表明抑制Sirt3表達(dá),上調(diào)COX-1亞基乙�；�。在這部分研究的基礎(chǔ)上,再通過0.5 ug/m L、1 ug/m L質(zhì)粒過表達(dá)Sirt3后,采用IP觀察COX-1亞基乙酰化水平,結(jié)果顯示Sirt3蛋白過表達(dá)后,COX-1亞基乙�；矫黠@降低。綜上實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明Sirt3對(duì)COX-1亞基乙�；哂姓{(diào)控作用。其次,使用自由基誘導(dǎo)劑AAPH導(dǎo)致NIH/3T3細(xì)胞發(fā)生凋亡,在此細(xì)胞模型中研究Sirt3對(duì)COX乙�；恼{(diào)控及作用。先根據(jù)噻唑藍(lán)染色觀察AAPH對(duì)NIH/3T3細(xì)胞的增殖抑制作用,利用細(xì)胞流式儀檢測(cè)ROS生成量和線粒體膜電位變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn),AAPH作用NIH/3T3細(xì)胞12 h后,細(xì)胞增殖受到明顯抑制,抑制率呈劑量依賴性增加,IC50為7.512±0.137 m M;5 m M、7.5 m M AAPH作用于NIH/3T3細(xì)胞12 h后ROS的生成量顯著增加,線粒體的膜電位明顯降低,細(xì)胞處于氧化應(yīng)激狀態(tài)。接下來采用Western blot檢測(cè)Caspase 3和Cyt c的蛋白表達(dá),液閃儀檢測(cè)ATP生成量,紫外分光光度計(jì)檢測(cè)COX的活性。結(jié)果顯示,給予AAPH后凋亡指示蛋白Cleaved Caspase 3表達(dá)明顯增多;分離細(xì)胞器后,檢測(cè)到胞漿中Cyt c蛋白表達(dá)量增加。結(jié)果顯示AAPH導(dǎo)致線粒體氧化應(yīng)激后,線粒體Cyt c釋放到胞質(zhì)中,激活Caspase 3,引起細(xì)胞凋亡。此外,AAPH誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡后,COX的活性顯著性降低,呼吸鏈障礙,導(dǎo)致細(xì)胞中ATP含量下降。最后,采用5m M AAPH作用于NIH/3T3細(xì)胞3、6、9、12 h后,通過Western blot觀察Sirt3蛋白表達(dá)及作用12 h后COX-1乙�；健＝Y(jié)果顯示給予AAPH后,NIH/3T3細(xì)胞中Sirt3的蛋白表達(dá)水平呈時(shí)間依賴性降低,COX-1的乙�；揭苍贏APH處理后明顯升高。以上結(jié)果提示,AAPH導(dǎo)致線粒體氧化應(yīng)激后,抑制Sirt3的蛋白表達(dá),引起COX-1的乙�；缴�,COX活性降低,無(wú)法正常接收Cyt c傳遞的電子,使Cyt c釋放到胞質(zhì)中,激活Caspase 3,引起細(xì)胞凋亡。最后,我們利用SD大鼠腦缺血/再灌注模型研究Sirt3對(duì)COX乙�；恼{(diào)控及作用。40只SD大鼠,隨機(jī)分為4組,每組10只。除假手術(shù)(sham)組外,其余各組根據(jù)體重采用不同線栓阻塞大鼠大腦中動(dòng)脈2 h后,拔出線栓,分別再灌注24 h、48 h、72 h,建立SD大鼠腦缺血/再灌注模型。采用2%紅四唑氮(2,3,5-tripheyl tetrazolium Chloride,TTC)避光染色半小時(shí),觀察腦組織梗死情況。心臟灌流后,取大鼠皮層,勻漿后取上清,利用熒光酶標(biāo)儀測(cè)定ROS生成速率。結(jié)果顯示再灌注不同時(shí)間后,各組腦組織梗死情況均明顯,梗死體積較Sham組有顯著性增加。同時(shí),與Sham組相比,各模型組再灌注大鼠ROS生成速率均明顯上升,再灌注72 h組ROS生成速率最快。進(jìn)一步研究中采用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)COX的活性,Western blot檢測(cè)Sirt3蛋白表達(dá),IP觀察COX-1亞基乙�；兓＝Y(jié)果提示大腦皮層中Sirt3的蛋白表達(dá)隨著再灌注時(shí)間的增加逐漸減少,72 h后達(dá)顯著水平。此外,缺血/再灌注后皮層組織中COX活性也受到明顯抑制,72 h后COX-1乙酰化水平顯著升高。總之,腦缺血/再灌注引起ROS大量釋放,出現(xiàn)氧化應(yīng)激,抑制Sirt3蛋白表達(dá),引起皮層中COX-1乙�；皆黾�,COX活性下降,出現(xiàn)Cyt c外流,激活凋亡因子,最終引起腦神經(jīng)細(xì)胞大量凋亡,出現(xiàn)腦梗死。綜上所述,Sirt3可以調(diào)控COX-1的乙�；健＞�粒體氧化應(yīng)激后,自由基大量釋放,引起Sirt3蛋白表達(dá)減少,導(dǎo)致COX-1乙�；皆黾�,COX活性下降,無(wú)法正常傳遞Cyt c轉(zhuǎn)移的電子,使攜帶大量負(fù)電荷的Cyt c被磷脂雙分子層翻轉(zhuǎn)釋放到胞漿中,導(dǎo)致Caspase家族被激活,啟動(dòng)凋亡信號(hào)通路。
【學(xué)位授予單位】：暨南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R96

【參考文獻(xiàn)】

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1 Eirini Pantazi;Mohamed Amine Zaouali;Mohamed Bejaoui;Emma Folch-Puy;Hassen Ben Abdennebi;Joan Roselló-Catafau;;Role of sirtuins in ischemia-reperfusion injury[J];World Journal of Gastroenterology;2013年43期

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本文編號(hào)：2514569