【摘要】：研究背景 藥物研發(fā)對醫(yī)療進步有十分重要的作用。在過去的幾十年里,針對心血管,腫瘤,消化系統(tǒng),疼痛等疾病的新藥研發(fā),為疾病治療提供了更多選擇,提高了人群健康水平,生活質(zhì)量及平均壽命。藥物研發(fā)是一個昂貴而且耗時的過程,盡管隨著科技的進步及投入的增加,但是仍然有90%的新藥不能成功進入臨床。近十年來,成功上市的新藥呈逐年下降趨勢,1996年有53種新藥通過FDA認證,但到2010年僅有15種。導致新藥研發(fā)失敗的原因有很多,其中主要原因是后期出現(xiàn)的各種藥物毒性反應和藥效作用不顯著。藥物研發(fā)過程中會對候選藥物的藥代動力學,藥效學,以及毒理學特征進行確認,但傳統(tǒng)研發(fā)體系缺乏能夠在早期準確高效分析藥物代謝作用、毒性反應的體外模型。 大部分藥物進入體內(nèi)后的代謝過程主要由肝細胞完成。肝細胞內(nèi)含有各種參與體內(nèi)外物質(zhì)生物轉(zhuǎn)化的酶類。其中,細胞色素P450酶(Cytochrome P450enzymes, CYPs, P450s)是一類含血色素巰基結(jié)構的單氧加酶蛋白超家族,是完成相關底物的去毒/生物活化作用的重要藥物代謝酶。其中,CYP3A亞家族在肝臟含有P450s中含量最高,約占30%,是主要的臨床藥物代謝酶類。目前發(fā)現(xiàn)CYP3A亞家族包括CYP3A4, CYP3A5, CYP3A7及CYP3A43. CYP3A4在肝細胞中含量最高達40%,其他組織如小腸,腎臟,肺臟,腦組織等也有CYP3A4的低水平表達。有趣的是,關于腦組織中的表達,Ghosh C et al.近期研究發(fā)現(xiàn)CYP3A4不僅參與了藥物代謝,還有保護神經(jīng)元細胞的作用。CYP3A4參與了50%的臨床用藥的代謝過程,藥物代謝譜非常廣泛,包括激素,免疫抑制劑,鈣離子通道阻滯劑,咖啡因及抗生素等。其中硝苯地平,咪達唑侖及睪酮是CYP3A4的特異性底物,常被用于CYP3A4活性水平檢測。有些藥物,如曲格列酮,胺碘酮等,經(jīng)CYP3A4代謝后能產(chǎn)生肝毒性,從而影響了其在臨床的應用。一些環(huán)境致癌物質(zhì)(如黃曲霉素B1)也具有經(jīng)CYP3A4代謝后的肝細胞毒性作用。另外,CYP3A4與藥物相互作用也是密切相關的,大量臨床用藥已被證明可以誘導或抑制CYP3A4的活性,使與這些藥物合用的其他藥物的血漿濃度減低或升高,導致合用藥物的療效減弱,或升高甚至產(chǎn)生毒性作用。如特非那定,米貝地爾,阿司咪唑及西伐他丁,由于嚴重的藥物相互作用已經(jīng)退出了市場。 鑒于CYP3A4在藥物代謝過程中的重要作用,藥物研發(fā)過程需要一個能夠再現(xiàn)體內(nèi)CYP3A4代謝作用的體外模型,用來集中評價CYP3A4對備選藥物代謝作用和水平,以及備選藥物對CYP3A4活性作用的影響。以肝臟藥物代謝功能為主要對象,現(xiàn)今用于藥物開發(fā)體外模型有：以亞細胞結(jié)構微粒體為單位的體外代謝模型和以細胞為單位的體外代謝模型(簡稱：細胞模型),以及組織器官代謝模型。亞細胞結(jié)構模型中,人肝細胞微粒體是現(xiàn)今最常用的體外模型,因為其來源廣,價格低廉且使用簡單；Supersomes是基因工程昆蟲細胞產(chǎn)生的微粒體,含有較高活性的CYP3A4[12];其他體外模型還有含有微粒體成分的人肝細胞S9成分等。這些體外模型不能真實反映體內(nèi)CYP3A4對藥物的代謝情況,也不能用于大致預測體內(nèi)藥物代謝水平的定量性分析,因此應用范圍有限。組織器官代謝模型是利用組織塊或完整器官進行體外藥物代謝測試的模型。這些模型雖然在最大程度上保證了代謝主體的完整性,這無疑有利于最大程度地再現(xiàn)體內(nèi)代謝過程,但其來源罕有并且組織活性維持困難、成本高,所以大多難以常規(guī)開展。細胞是機體內(nèi)最小的完整功能執(zhí)行者；細胞模型,較單純的生化模型、細胞器模型,具有更能體現(xiàn)機體生理活動的結(jié)構基礎和功能能力；較組織器官代謝模型,在技術應用上具有更大的可行性。以細胞為基本功能單位的分析模型(Cell-based assay, CBA)是現(xiàn)代藥物研發(fā)技術中受到推崇而日益增多使用的模型工具。因此,研發(fā)一個CYP3A4高表達的細胞模型,對藥物開發(fā)就顯得十分重要。 研究目的 本實驗以C3A細胞為研究對象,通過轉(zhuǎn)染編碼嵌合型hPXR的質(zhì)粒,以提高其CYP3A4的表達水平及藥物代謝能力,從而增強C3A細胞在藥物研發(fā)的應用潛質(zhì)。 實驗方法 1.根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫收錄的hPXR及p53-AD的基因序列,設計特異引物,采用聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction,PCR)技術以正常人肝組織的cDNA為模板克隆hPXR及p53-AD的基因序列。 2.根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫收錄的CYP3A4的基因序列,設計特異引物,采用PCR技術以正常人肝組織的cDNA為模板克隆CYP3A4-362至+53部分和-7838至-7208之間的調(diào)控序列的基因序列。 3.通過限制性內(nèi)切酶位點,將hPXR及p53-AD基因定向克隆到真核表達載體pCI-neo上,采用酶切、測序等方法篩選和鑒定重組真核表達載體pCI-hPXR-p53。 4.通過限制性內(nèi)切酶位點,將hPXR及p53-AD基因定向克隆到真核表達載體pCI-neo上,采用酶切、測序等方法篩選和鑒定重組真核表達載體pCI-p53-hPXR。 5.通過限制性內(nèi)切酶位點,將CYP3A4-362至+53部分和-7838至-7208之間的調(diào)控序列定向克隆到真核表達載體pGL3-basic上,采用酶切、測序等方法篩選和鑒定重組真核表達載體CYP3A4.XREM.luc。 6.將已經(jīng)構建好的載體pCI-hPXR-p53用Nhe I/BamH I酶切下來,和pcDNA3.1(+)的Nhe I/BamH I酶切產(chǎn)物連接,得到一個中間載體pcDNA3.1-hPXR。在中間載體上獲得EcoR I酶切位點。將pcDNA3.1-hPXR的Nhe I/EcoR I酶切產(chǎn)物和pCI-neo的Nhe I/EcoR I酶切產(chǎn)物連接,采用酶切鑒定亞克隆載體pCI-hPXR。 7.將目的質(zhì)粒(pCI-neo、pCI-hPXR、pCI-hPXR-p53及pCI-p53-hPXR):報告基因質(zhì)粒(CYP3A4.XREM.luc):內(nèi)參質(zhì)粒(TK)分別按46ng:140ng:14ng瞬時轉(zhuǎn)染HEK293T細胞和C3A細胞。轉(zhuǎn)染24小時后,利福平組加入0.2μl10mM的利福平溶液,對照組加入0.2μl DMSO,藥物刺激48小時后,進行雙熒光素酶檢測。 8.將質(zhì)粒pCI-neo、pCI-hPXR、pCI-hPXR-p53及pCI-p53-hPXR分別轉(zhuǎn)染C3A細胞。轉(zhuǎn)染24小時后,利福平組加入2μl10mM的利福平溶液,對照組加入2μl DMSO。藥物刺激48小時后,收集細胞進行實時熒光定量PCR (Q-PCR)檢測。 9.嵌合型hPXR質(zhì)粒轉(zhuǎn)染C3A細胞后,經(jīng)G418抗生素篩選,得到增殖的陽性單克隆,擴大培養(yǎng)后,利用Q-PCR技術檢測各個陽性克隆CYP3A4mRNA的表達情況。根據(jù)Q-PCR結(jié)果,挑選出CYP3A4mRNA表達最高的單克隆。 10. Western blot檢測野生型(WT)C3A細胞及穩(wěn)定表達嵌合型hPXR的C3A細胞的CYP3A4蛋白表達情況。 11.提取WT C3A細胞及穩(wěn)定表達嵌合型hPXR的C3A細胞的微粒體,以睪酮為底物,利用高效液相色譜技術(HPLC)檢測睪酮代謝物(6β-OH睪酮)的生成率,以評價CYP3A4酶的代謝活性。 12.在6孔板中分別培養(yǎng)WT C3A細胞及穩(wěn)定表達嵌合型hPXR的C3A細胞,以睪酮為底物,利用HPLC技術檢測睪酮代謝物(6β-OH睪酮)的生成率,以評價CYP3A4酶的代謝活性。 實驗結(jié)果 1.以正常人肝組織的cDNA為模板,用特異性引物克隆得到了p53-AD及hPXR基因片段； 2.通過限制性內(nèi)切酶,將p53-AD及hPXR基因定向克隆到真核表達載體pCI-neo上,篩選得到有p53-AD及hPXR基因插入的真核表達載體pCI-hPXR-p53及pCI-p53-hPXR; 3.以正常人肝組織的cDNA為模板,用特異性引物克隆得到了CYP3A4-362至+53部分和-7838至-7208之間的調(diào)控序列的基因序列； 4.通過限制性內(nèi)切酶,將CYP3A4-362至+53部分和-7838至-7208之間的調(diào)控序列基因序列定向克隆到真核表達載體pGL3-basic上,篩選得到有CYP3A4-362至+53部分和-7838至-7208之間的調(diào)控序列基因序列插入的真核表達載體CYP3A4.XREM.luc; 5.將已經(jīng)構建好的載體pCI-hPXR-p53用Nhe I/BamH I酶切下來,和pcDNA3.1(+)的Nhe I/BamH I酶切產(chǎn)物連接,得到一個中間載體pcDNA3.1-hPXR。在中間載體上獲得EcoR I酶切位點。將pcDNA3.1-hPXR的Nhe I/EcoR I酶切產(chǎn)物和pCI-neo的Nhe I/EcoR I酶切產(chǎn)物連接,通過酶切鑒定,得到亞克隆載體pCI-hPXR; 6.在轉(zhuǎn)染的HEK293T細胞中,雙熒光素酶報告基因檢測質(zhì)粒pCI-neo, pPCI-hPXR, pCI-hPXR-p53及pCI-p53-hPXR對報告基因質(zhì)粒CYP3A4.XREM.luc的作用。在R1f(+)組中,轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pCI-hPXR-p53、pCI-p53-hPXR后,1uciferase活性高于pCI-hPXR及pCI-neo,且pCI-hPXR-p53對luciferase活性的增強作用比普通型pCI-hPXR高1.5倍,pCI-p53-hPXR比普通型pCI-hPXR高9.5倍,具有統(tǒng)計學差異(p0.05)；在Rif(—)組中亦是如此(p0.05)。 7.在轉(zhuǎn)染的C3A細胞中,雙熒光素酶報告基因檢測質(zhì)粒pCI-neo、 pCI-hPXR、pCI-hPXR-p53及pCI-p53-hPXR對報告基因質(zhì)粒的作用。在Rif(+)組中,轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pCI-hPXR-p53、pCI-p53-hPXR后,對luciferase活性的增強作用高于pCI-hPXR及pCI-neo,且pCI-hPXR-p53對luciferase活性的增強作用比普通型pCI-hPXR高5.4倍,pCI-p53-hPXR比普通型pCI-hPXR高9.1,具有統(tǒng)計學差異(p0.05)；在Rif(—)組中亦是如此(p0.05)。 8.質(zhì)粒pCI-hPXR-p53、pCI-p53-hPXR、pCI-hPXR及pCI-neo瞬時轉(zhuǎn)染C3A細胞后,通過Q-PCR檢測CYP3A4mRNA的變化。在Rif(+)組中,質(zhì)粒pCI-hPXR-p53、pCI-p53-hPXR轉(zhuǎn)染后,CYP3A4mRNA的表達高于pCI-hPXR及pCI-neo,具有統(tǒng)計學差異(p0.05)；且pCI-hPXR-p53對CYP3A4mRNA表達的增強作用是普通型pCI-hPXR的2.3倍,pCI-p53-hPXR比普通型pCI-hPXR高1.65倍；在Rif(—)組中亦是如此(p0.05)。 9.嵌合型hPXR質(zhì)粒轉(zhuǎn)染C3A細胞后,經(jīng)G418篩選,得到了13個增殖的陽性單克隆,其中包括7個穩(wěn)定表達pCI-hPXR-p53的細胞系(A1-A7)和6個穩(wěn)定表達pCI-p53-hPXR的細胞系(B1-B6)。 10. Q-PCR檢測13個單克隆的CYP3A4mRNA表達情況發(fā)現(xiàn),A5細胞系中CYP3A4mRNA的表達最高,是WTC3A細胞的2.5倍(p0.05),故挑選它進行下一步研究。 11.Western blot檢測CYP3A4蛋白的表達情況發(fā)現(xiàn),CYP3A4蛋白在A5細胞系中的表達比WTC3A細胞提高了1.5倍(p0.05)。 12.WTC3A細胞在微粒體水平及細胞水平均未檢測到6β-OH睪酮的生成,而A5細胞系在細胞水平及微粒體水平檢測到6β-OH睪酮的生成率分別為55pmol/mg protein/min和714pmol/mg protein/min,可見A5細胞系的藥物代謝能力顯著提高。 實驗結(jié)論 成功構建了pCI-hPXR-p53、pCI-p53-hPXR、pCI-hPXR及CYP3A4.XREM.luc4個真核表達載體,雙熒光素酶報告基因檢測發(fā)現(xiàn),嵌合hPXR(pCI-hPXR-p53、 pCI-p53-hPXR)對CYP3A4啟動子的反式激活作用比pCI-hPXR更強,并Q-PCR結(jié)果進一步證實了嵌合型hPXR對CYP3A4的激活轉(zhuǎn)錄作用更強。 嵌合型hPXR質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染C3A細胞后,得到了CYP3A4mRNA表達最高的A5細胞系。它的CYP3A4蛋白表達和CYP3A4介導的藥物代謝能力也得到了相應的提高,這無疑是為藥物代謝和毒性研究提供了一個新的體外細胞模型。
文內(nèi)圖片：
圖片說明：pCI-p53-hPXR骨架Figure1-2ThebackboneofpCI-p53-hPXR
[Abstract]:......
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R969.1

【共引文獻】

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本文編號：2512431