【摘要】：第一章MTT法檢測ZHC116對NIH3T3細(xì)胞增殖的影響 研究背景：纖維化是指纖維結(jié)締組織在細(xì)胞外大量沉積的過程,可累及多個臟器,嚴(yán)重危害人類健康,目前臨床上尚缺乏特效藥物治療。吡啶酮類化合物是新型廣譜抗炎、抗纖維化的藥物,其代表藥物吡非尼酮(Pirfenidone,5-甲基1-苯基2-(1H)吡啶酮),在日本及歐洲已批準(zhǔn)用于治療特發(fā)性肺纖維化(Idiopathic Pulmonary Fibrosis, IPF)。氟非尼酮(fluorofenidone, AKF-PD)是本課題組獨(dú)立研發(fā)的吡非尼酮的me-better藥物,已申請一期臨床研究。ZHC116是本課題組新近合成并篩選出來的另一吡啶酮類化合物,較AKF-PD及吡非尼酮,具有效果更強(qiáng)、副作用小、治療窗廣等特點(diǎn)。前期研究證實,ZHC116具有較強(qiáng)的抗纖維化效應(yīng)。纖維化的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,其中成纖維細(xì)胞增殖起重要作用。成纖維細(xì)胞是產(chǎn)膠原細(xì)胞(即肌成纖維細(xì)胞)的主要來源,經(jīng)活化后可分泌大量一、三型膠原和纖連蛋白,從而導(dǎo)致器官纖維化的發(fā)生。MTT比色法,是一種常用的檢測細(xì)胞增殖的方法,具有簡便、快速、易標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點(diǎn),在國內(nèi)外已被廣泛應(yīng)用于藥物篩選、細(xì)胞毒性檢測等領(lǐng)域。MTT檢測藥物對NIH3T3細(xì)胞(小鼠胚胎成纖維細(xì)胞)增殖的影響可部分反映藥物的抗纖維化效能。 目的：檢測ZHC116對NIH3T3細(xì)胞增殖的影響,探索藥物作用的有效濃度范圍。 方法：以NIH3T3細(xì)胞株為研究對象,加入濃度梯度的藥物ZHC116(0.05mM、0.1mM、0.15mM.0.20mM),分別孵育48或72小時,MTT法比較各組吸光度值,計算半效抑制濃度(IC50)。 結(jié)果：0.05mM的ZHC116對NIH3T3細(xì)胞無明顯抑制作用,在0.10-0.20mM的濃度范圍內(nèi),隨濃度的增高及作用時間的延長,ZHC116對NIH3T3細(xì)胞的抑制率逐漸增高。 結(jié)論：在0.10-0.20mM濃度范圍內(nèi),ZHC116對NIH3T3細(xì)胞的增殖具有抑制作用。 第二章ZHC116對內(nèi)毒素血癥小鼠死亡率及炎癥因子IL-1β的影響 研究背景：本課題組前期研究證實,ZHC116可以減輕腎纖維化模型早期巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等炎癥細(xì)胞浸潤,減輕腎間質(zhì)損傷,提示潛在的抗炎作用,而其對全身炎癥反應(yīng)的作用不明。內(nèi)毒素血癥是全身炎癥反應(yīng)綜合征的經(jīng)典模型。在脂多糖(LPS)刺激下,大量炎癥介質(zhì)基因過度表達(dá),從而導(dǎo)致過度炎癥反應(yīng)和免疫紊亂。NALP3炎性體是由凋亡相關(guān)微粒蛋白(ASC)、caspase蛋白酶以及NOD樣受體(NLRP3)組成的復(fù)合體,是天然免疫系統(tǒng)的重要組成部分。其能激活caspase-1,活化的caspase-1切割前體IL-1β為成熟體。NALP3. ASC、caspase-1基因敲除對內(nèi)毒素小鼠具有保護(hù)作用。IL-1β是經(jīng)典的早期炎癥因子,亦可作為炎性體活化的標(biāo)志。我們前期研究發(fā)現(xiàn),AKF-PD能有效改善內(nèi)毒素血癥小鼠的死亡率,并降低IL-1β的水平。而ZHC116在此方面的作用尚待研究。 目的：觀察ZHC116對內(nèi)毒素血癥模型小鼠死亡率及炎癥因子IL-1β的影響。 方法：取64只Balb/c小鼠隨機(jī)分為以下四組：對照組、LPS模型組、ZHC116(50mg/kg)及AKF-PD (200mg/kg)治療組。LPS模型組及藥物處理組予以LPS (15mg/kg)腹腔注射,同時腹腔內(nèi)給予藥物或等體積的PBS,記錄各組小鼠第0-144小時存活只數(shù)。另取40只Balb/c小鼠,按同樣方式分組,每組10只,藥物(或PBS)與LPS同時腹腔注射,2小時后取血,ELISA檢測炎癥因子IL-1β。 結(jié)果：144小時內(nèi),對照組無小鼠死亡,LPS組死亡率明顯升高,達(dá)87.5%(死亡數(shù)/總數(shù)=14/16)；腹腔注射ZHC116(50mg/kg)及AKF-PD (200mg/kg)均能顯著降低內(nèi)毒素血癥小鼠的死亡率,分別為43.75%(7/16,ZHC116組)和31.25%(5/16,AKF-PD組),兩組較LPS組,均有統(tǒng)計學(xué)差異。兩藥物治療組之間無明顯差異。LPS腹腔注射2小時后,小鼠血清中IL-1β的濃度明顯增高,ZHC116(50mg/kg)及AKF-PD (200mg/kg)治療后明顯下降,兩治療組之間無統(tǒng)計學(xué)差異。 結(jié)論：ZHC116對內(nèi)毒素血癥小鼠具有保護(hù)作用,并能降低內(nèi)毒素血癥小鼠血清中IL-1β的水平。ZHC116(50mg/kg)與AKF-PD(200mg/kg)作用相當(dāng)。 第三章ZHC116對腹腔巨噬細(xì)胞表達(dá)IL-1β及對NALP3炎性體的影響 研究背景：腹腔巨噬細(xì)胞是內(nèi)毒素血癥的的主要作用細(xì)胞。LPS刺激后,腹腔巨噬細(xì)胞一方面負(fù)責(zé)清除細(xì)菌病原體及壞死的組織、細(xì)胞等。另一方面分泌大量的炎性因子介質(zhì)(如IL-1β),介導(dǎo)炎癥反應(yīng)。炎性體主要存在于巨噬細(xì)胞中,在內(nèi)毒素血癥中介導(dǎo)免疫細(xì)胞的死亡和機(jī)體的免疫抑制。 前一部分的研究發(fā)現(xiàn),ZHC116能降低內(nèi)毒素血癥小鼠血清中IL-1β的水平,但具體作用于IL-1β的合成水平還是通過作用于炎性體影響IL-1β的成熟尚不清楚。 目的：探討ZHC116對LPS誘導(dǎo)腹腔原代巨噬細(xì)胞表達(dá)和釋放IL-1β及對炎性體組分NALP3及caspase-1表達(dá)的影響 方法：獲取小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞,分為四組：對照組、LPS刺激組及ZHC116(0.1mM)治療組。予ZHC116(0.1mM)處理24小時后,予以LPS (1μg/ml)刺激細(xì)胞,24小時后收集細(xì)胞上清及提取細(xì)胞總RNA及總蛋白。以ELISA法檢測細(xì)胞外IL-1β的水平,同時行熒光定量PCR、western blot檢測前體IL-1β的水平,并行熒光定量PCR檢測ZHC116對NALP3炎性體的主要組分NALP3、caspase-1mRNA表達(dá)的影響。 結(jié)果：LPS (1μg/ml)刺激24小時后,上清的IL-1β水平明顯增高,給予ZHC116(0.1mM)處理后,IL-1β水平明顯降低。熒光定量PCR及前體IL-1β的western結(jié)果顯示,ZHC116(0.1mM)能顯著抑制IL-1β的轉(zhuǎn)錄。NALP3及caspase-1的熒光定量PCR結(jié)果顯示,LPS刺激后,這兩者的轉(zhuǎn)錄水平均增高,而ZHC116(0.1mM)對其有抑制作用。結(jié)論：ZHC116能降低巨噬細(xì)胞中IL-1β的表達(dá)和釋放,并可能通過抑制NALP3炎性體的表達(dá)而發(fā)揮作用。
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【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R96

【參考文獻(xiàn)】

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1 雷玲;鐘小寧;趙鋮;米存東;李佳荃;曾晶晶;;Th17細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞因子在系統(tǒng)性硬化病小鼠模型中的表達(dá)及意義[J];北京大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版);2012年02期

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本文編號：2471559