發(fā)布時(shí)間：2019-04-19 02:38

【摘要】：自上世紀(jì)以來(lái),血栓性疾病一直是危害人類健康和生命安全的頭號(hào)因素,溶栓療法是目前臨床上使用最廣泛而有效的一種治療方法,而且溶栓藥物已經(jīng)歷了三代發(fā)展。人組織纖溶酶原激活劑(tissue-type plasminogen activator, t-PA)是由血管內(nèi)皮細(xì)胞合成并分泌的一種絲氨酸蛋白酶,能夠高效特異地溶解血栓,是一種良好的第二代溶栓藥物。重組人纖溶酶原激活劑(recombinant human plasminogen activator, rhPA)是天然t-PA的重組突變體,屬于新型第三代溶栓藥物,具有較天然t-PA更加優(yōu)越的溶栓功能。利用動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器來(lái)生產(chǎn)t-PA及其重組突變體,具有產(chǎn)量高、成本低、翻譯后修飾、生物活性高等優(yōu)于其它表達(dá)系統(tǒng)的特點(diǎn)。應(yīng)用多種純化技術(shù)相結(jié)合的策略,能夠方便、快捷、高效地將目標(biāo)蛋白從動(dòng)物乳汁中分離純化出來(lái)�，F(xiàn)今,國(guó)內(nèi)外已有很多關(guān)于以上研究?jī)?nèi)容的報(bào)道。本研究目的旨在：將構(gòu)建正確而有效的rhPA乳腺特異性表達(dá)載體(F、E、K1區(qū)缺失重組體t-PA)應(yīng)用到轉(zhuǎn)基因兔中,研究其表達(dá)水平和活性功能,以期獲得高效表達(dá)rhPA的轉(zhuǎn)基因兔；研究各種分離純化表達(dá)兔乳中rhPA的方法和策略,以期獲得高純度、高回收率、高活性的rhPA;研究小鼠血栓和溶栓模型,以期獲得最佳的動(dòng)物溶栓效果；同時(shí),還研究了rhPA單克隆抗體的制備和篩選方法,以期獲得能夠用作親和層析配體的多羥基反應(yīng)單克隆抗體(PR-mAb)。從而,最終獲得一種新穎、高效的溶栓藥物。相關(guān)研究方法和結(jié)果如下：1.采用常規(guī)分子生物學(xué)技術(shù),分別以山羊p-酪蛋白基因(β-casein)、山羊p-乳球蛋白基因(BLG)和牛αs1酪蛋白基因(asl-casein)作為調(diào)控元件,以天然t-PA的F、E、K1區(qū)缺失體作為編碼蛋白序列,構(gòu)建了乳腺特異性表達(dá)載體PCL25/rhPA、BLC14/rhPA和AP/rhPA。經(jīng)酶切圖譜和測(cè)序比對(duì)結(jié)果顯示,構(gòu)建的載體與理論序列完全一致。2.通過(guò)膠原酶消化組織法建立山羊乳腺上皮細(xì)胞分離培養(yǎng)體系,電轉(zhuǎn)染三種載體,經(jīng)600μg/mL G418篩選兩周后,挑取生長(zhǎng)旺盛、狀態(tài)較好的單克隆細(xì)胞集落,傳代擴(kuò)大培養(yǎng)。經(jīng)PCR檢測(cè),PCL25/rhPA、BLC14/rhPA、AP/rhPA三種載體分別獲得了79株、66株、63株整合陽(yáng)性單克隆細(xì)胞株,并應(yīng)用51μM催乳素進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。ELISA檢測(cè)72h后細(xì)胞誘導(dǎo)上清液,25株轉(zhuǎn)PCL25/rhPA基因細(xì)胞株高水平表達(dá)rhPA,3株轉(zhuǎn)BLC14/rhPA基因細(xì)胞株表達(dá)rhPA,而轉(zhuǎn)AP/rhPA基因細(xì)胞株未見(jiàn)表達(dá)。經(jīng)纖維蛋白平板溶圈法(FAPA)檢測(cè),所有誘導(dǎo)表達(dá)上清液均具有體外溶栓活性功能。結(jié)果表明,在細(xì)胞水平,PCL25/rhPA和BLC14/rhPA載體能夠有效地驅(qū)動(dòng)rhPA基因特異性表達(dá),且PCL25/rhPA載體的表達(dá)水平明顯高于其它兩種載體。從而,驗(yàn)證了構(gòu)建的PCL25/rhPA載體是合理而有效的。3.將以上三個(gè)構(gòu)建(PCL25/rhPA、BLC14/rhPA、AP/rhPA)經(jīng)顯微注射導(dǎo)入到兔受精卵中,共移植94只受體,妊娠71只,出生319只仔兔,PCR檢測(cè)85只為轉(zhuǎn)基因整合陽(yáng)性兔,妊娠率為75.5%(71/94),整合率為26.6%(85/319)。ELISA檢測(cè)57只存活轉(zhuǎn)基因兔(或后代)乳汁,共12只乳腺特異性表達(dá)rhPA (PCL25/rhPA11只,BLC14/rhPA1只),表達(dá)水平約在5.2-630 μg/mL之間。SDS-PAGE電泳和Western Blot檢測(cè)該12只兔乳,均出現(xiàn)約39KDa大小的目標(biāo)特異性條帶。FAPA結(jié)合ELISA測(cè)定表達(dá)產(chǎn)物的體外溶栓比活性,最高可達(dá)360倍左右(A29,與阿替普酶相比)。測(cè)交檢測(cè)高表達(dá)水平的A29系轉(zhuǎn)基因兔,1只F2代(A29F2-09)的所有后代仔兔均為整合陽(yáng)性(100%,13/13)；Real-time PCR檢測(cè)相對(duì)拷貝數(shù),該只兔約是其它同系轉(zhuǎn)基因兔的2倍。從而,證明了A29F2-09為純合子轉(zhuǎn)基因兔,且rhPA表達(dá)水平約1000μg/mL,明顯高于非純合子兔；不同系轉(zhuǎn)基因兔拷貝數(shù)與表達(dá)水平間沒(méi)有相關(guān)性。以上結(jié)果表明,PCL25/rhPA載體能夠在轉(zhuǎn)基因兔乳腺中高效表達(dá)活性rhPA;表達(dá)水平主要與整合位點(diǎn)有關(guān)；當(dāng)整合位點(diǎn)一致時(shí),表達(dá)水平隨拷貝數(shù)的增加也相應(yīng)地累積提高。4.通過(guò)傳統(tǒng)弗氏佐劑和快速免疫佐劑兩種方法免疫小鼠,結(jié)果顯示在免疫小鼠血清效價(jià)、免疫原劑量和免疫周期上,快速免疫佐劑都大大地優(yōu)越于弗氏佐劑(1010/109,20μg/1300μg,35d/70d)。通過(guò)電脈沖和化學(xué)PEG兩種方法將免疫后的小鼠脾臟淋巴細(xì)胞與SP2/0小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合,結(jié)果顯示電融合效率明顯高于化學(xué)PEG融合(166%/88.4%)。通過(guò)HAT和HT篩選及有限稀釋法亞克隆后,共獲得12株能夠穩(wěn)定分泌高效價(jià)抗體的雜交瘤細(xì)胞株(標(biāo)號(hào)Cl-C12)。ELISA-elution檢測(cè),有3株為多羥基反應(yīng)單克隆抗體(PR-mAb,標(biāo)號(hào)C1、C4、C8),占單克隆抗體總數(shù)的25%(3/12)。小鼠腹腔誘導(dǎo)法大量制備抗體,C1、C4、C8株腹水效價(jià)分別是108、1010、108,且無(wú)交叉非特異性反應(yīng),能夠?yàn)橛H和層析所用。5.通過(guò)離心脫脂、35%飽和硫酸銨沉淀、超濾及透析等方法進(jìn)行兔乳前處理,獲得粗純樣品。將C4株抗體與CNBr activated Bestarose 4FF偶聯(lián)來(lái)制備免疫親和層析柱,偶聯(lián)率高達(dá)96.5%。嘗試五種不同的洗脫液(A:0.1mol/L甘氨酸,pH2.5;B:0.1mol/L甘氨酸,pH3.5；C:0.1mol/L甘氨酸,pH5.0; D:0.75mol/L硫酸銨+40%丙二醇的TE緩沖液,pH7.9; E:0.2M NaH2PO4-檸檬酸,pH2.2),來(lái)探索最佳洗脫效果的條件,結(jié)果顯示0.75mol/L硫酸銨+40%丙二醇的TE緩沖液(pH7.9)洗脫效果最佳,但pH較低的強(qiáng)酸緩沖液(A、B、E)也能夠達(dá)到洗脫要求,而pH較高的C洗脫液則出現(xiàn)雜蛋白較多且回收率低。再嘗試Chromdex75 prep grade凝膠過(guò)濾預(yù)裝柱來(lái)進(jìn)一步分離純化目標(biāo)蛋白rhPA,上樣體積為1%和2.5%能夠?qū)⒛繕?biāo)蛋白完全分開(kāi),出現(xiàn)兩個(gè)獨(dú)立的峰；而上樣體積為5%則不能夠?qū)⒛繕?biāo)蛋白完全分開(kāi),出現(xiàn)兩個(gè)相互交叉重疊峰。經(jīng)免疫檢測(cè)及飛行時(shí)間質(zhì)譜鑒定該純化產(chǎn)物為目標(biāo)rhPA。與BSA對(duì)照品相比,雙向電泳結(jié)果顯示,純化產(chǎn)物的大小約39KDa(在35-40KDa之間),等電點(diǎn)約7.1(BSA等電點(diǎn)約4.7),純度可達(dá)96%-99%或更高(BSA純度96%-99%)。與阿替普酶對(duì)照品相比,圓二色譜分析顯示,該純化產(chǎn)物與阿替普酶有相似的二級(jí)結(jié)構(gòu)；FAPA測(cè)定純化產(chǎn)物rhPA的體外溶栓比活性,其值高達(dá)約214倍,遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于阿替普酶溶栓藥。6.以HitrapTM CaptoTM Q-1mL離子交換柱去內(nèi)毒素,經(jīng)試劑盒測(cè)試,內(nèi)毒素含量低于0.015EU/mL.分別以0.3mL/只小鼠腹腔注射1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%濃度的角叉菜膠,來(lái)探索誘導(dǎo)小鼠尾部血栓形成的最佳條件,結(jié)果顯示以0.05%濃度的角叉菜膠誘導(dǎo)小鼠尾部血栓形成條件最佳。以不同的“給藥”濃度(低劑量組0.1mg/只、中劑量組0.4mg/只、高劑量組1.6mg/只及阿替普酶、生理鹽水對(duì)照組)對(duì)小鼠血栓模型病進(jìn)行治療,結(jié)果顯示純化產(chǎn)物rhPA作為溶栓藥物治療小鼠尾部血栓,在效果和劑量上明顯優(yōu)越于阿替普酶,且rhPA高劑量組(1.6mg/只)在三次給藥后(32h)能夠完全治愈小鼠尾部血栓疾病。以上結(jié)果表明,我們構(gòu)建的F、E、K1區(qū)缺失重組體t-PA (PCL25/rhPA載體)是合理、有效的,且能夠在轉(zhuǎn)基因兔乳腺中高效表達(dá)；表達(dá)產(chǎn)物rhPA能夠相對(duì)單獨(dú)地存在于兔乳中,且能夠被分離純化出來(lái)；純化產(chǎn)物具有高回收率、高純度、高生物活性功能,且能夠用于動(dòng)物溶栓模型試驗(yàn),具有較阿替普酶對(duì)照品更好的療效。同時(shí),也證明了我們所建立的這一整套技術(shù)體系是相對(duì)完善、可行的,在國(guó)內(nèi)外較少見(jiàn)報(bào)道,為以后大量新型重組溶栓藥物的研發(fā)提供了新的思路,也為后期進(jìn)一步臨床試驗(yàn)奠定了扎實(shí)的基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R915;R965

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2460523