【摘要】：目的:本文旨在探討研究Jaspis stellifera海綿來(lái)源的三萜類化合物Stellettin B(Stel B)對(duì)人慢性粒細(xì)胞白血病(CML)細(xì)胞的體外抗癌活性及分子機(jī)理,為此類藥物的研發(fā)及用于慢性粒細(xì)胞白血病治療提供一定的理論依據(jù)與指導(dǎo)。方法:1.利用WST-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Stel B對(duì)K562、KU812細(xì)胞的增殖抑制作用;從中選取對(duì)藥物較敏感的細(xì)胞系(K562細(xì)胞),進(jìn)一步采用軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)Stel B的細(xì)胞增殖抑制活性。2.在藥物聯(lián)合應(yīng)用研究中,利用MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Stel B單用或與Imatinib聯(lián)合用藥對(duì)K562細(xì)胞的增殖抑制活性,計(jì)算藥物IC50值,分析其藥效協(xié)同作用。3.利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)Stel B對(duì)細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞內(nèi)ROS及線粒體膜電位的影響。4.利用Western blot檢測(cè)濃度梯度Stel B處理K562細(xì)胞前后,細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白因子的表達(dá)水平變化;利用Western blot檢測(cè)Stel B處理K562細(xì)胞前后,細(xì)胞中PI3K/Akt通路中相關(guān)分子表達(dá)或磷酸化水平變化。5.利用siRNA方法降表達(dá)Stat5后,采用Western blot檢測(cè)Stel B對(duì)K562細(xì)胞中Stat5信號(hào)通路和PI3K/Akt信號(hào)通路關(guān)鍵分子表達(dá)或磷酸化水平的影響。6.應(yīng)用Chou and Talalay’s方法研究Stel B與Imatinib聯(lián)合應(yīng)用,借助Calcu Syn軟件計(jì)算Fa-CI值,分析兩藥聯(lián)合是否具有協(xié)同藥效。結(jié)果:1.Stel B具有抑制CML細(xì)胞增殖活性。WST-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,Stel B呈劑量依賴性方式抑制K562,KU812細(xì)胞增殖,藥物IC50值分別為0.035,0.95μM;Stel B對(duì)健康人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)顯示較低細(xì)胞毒作用,其IC50值大于39μM。選取CML K562細(xì)胞進(jìn)行軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示,Stel B給藥組的細(xì)胞克隆形成率及單個(gè)克隆大小均小于對(duì)照組,進(jìn)一步證明Stel B具有抑制CML K562細(xì)胞增殖活性。2.Stel B對(duì)K562細(xì)胞未見(jiàn)明顯的細(xì)胞周期阻滯作用。3.Stel B具有誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡活性。Annexin V-FITC/PI雙染結(jié)合流式細(xì)胞儀分析顯示,Stel B處理組的凋亡細(xì)胞數(shù)目(7.5%、22.44%、26.1%、32.2%、44.6%)較對(duì)照組(5.41%)顯著提高;Stel B處理組中凋亡相關(guān)蛋白Bad,Bax表達(dá)增加,Bcl-2表達(dá)降低,Caspase-9、Caspase-3、PARP的裂解片段增加。Stel B誘導(dǎo)K562細(xì)胞內(nèi)ROS水平增加,線粒體膜電位水平降低,且呈劑量依賴性。4.Western blot結(jié)果顯示Stel B可顯著降低K562細(xì)胞中PI3K 4種催化亞基和調(diào)節(jié)亞基PI3K-p85的表達(dá)水平。此外,可降低Stat5、PDK1、Akt、m TOR和p70S6K蛋白磷酸化水平。分別應(yīng)用小分子抑制劑SH-4-54和si RNA抑制Stat5的表達(dá)和活性,并采用Western blot檢測(cè)了PI3K的表達(dá)水平和PDK1、Akt的磷酸化水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,沉默或抑制細(xì)胞內(nèi)Stat5后,PI3K催化亞基p110α、p110β、p110γ、p110δ和調(diào)節(jié)亞基p85的表達(dá)水平均有不同程度的降低,其中p110β的降表達(dá)最為顯著;PDK1、Akt的磷酸化水平也明顯降低。當(dāng)進(jìn)一步引入Stel B干預(yù)后,PI3K-p110β、p85的表達(dá)和PDK1、Akt的磷酸化水平降低更為顯著,說(shuō)明Stel B抑制K562細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)凋亡的活性可能是通過(guò)調(diào)控Stat5和PI3K/Akt通路實(shí)現(xiàn)的,且Stat5和PI3K/Akt通路存在一定的相關(guān)性。5.應(yīng)用Chou and Talalay’s方法研究Stel B與Imatinib聯(lián)合應(yīng)用,結(jié)果顯示當(dāng)采用IC50 Stel B?5×IC50 Imatinib藥物濃度比時(shí),Stel B與Imatinib聯(lián)合用藥指數(shù)CI值1,說(shuō)明藥物聯(lián)合具有協(xié)同藥效。軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明聯(lián)合用藥組較藥物單用組形成的克隆大小及克隆數(shù)均顯著降低。利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡作用,結(jié)果顯示Stel B與Imatinib聯(lián)合應(yīng)用對(duì)K562細(xì)胞的凋亡作用更強(qiáng)。通過(guò)檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白發(fā)現(xiàn)聯(lián)合應(yīng)用后Caspase-3,PARP的裂解片段明顯增加。以上結(jié)果說(shuō)明藥物聯(lián)合應(yīng)用組抑制K562細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡活性均強(qiáng)于藥物單用組,顯示出協(xié)同藥效。結(jié)論:1.Stel B體外抗CML作用主要體現(xiàn)在對(duì)K562細(xì)胞的抑制增殖、誘導(dǎo)凋亡活性,其分子作用機(jī)制可能是通過(guò)調(diào)控Stat5和PI3K/Akt信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。本實(shí)驗(yàn)首次闡明了海洋來(lái)源天然產(chǎn)物Stel B對(duì)CML的體外抗腫瘤作用及分子機(jī)制。2.Stel B與Imatinib聯(lián)合應(yīng)用在IC50 Stel B?5×IC50 Imatinib的用藥濃度比例下顯示出協(xié)同藥效,該協(xié)同作用主要體現(xiàn)在抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)凋亡兩個(gè)方面。實(shí)驗(yàn)結(jié)果為Stel B類藥物的研發(fā)及用于治療CML提供了初步理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R96

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本文編號(hào)：2455070