【摘要】：構(gòu)建GLP-1-Fc蛋白真核表達(dá)載體,并在DG44細(xì)胞株中實(shí)現(xiàn)表達(dá)。利用基因工程等方法構(gòu)建表達(dá)GLP-1-Fc融合蛋白的重組DG44細(xì)胞株,通過甲氨喋呤的加壓篩選及有限稀釋法挑選出表達(dá)量較高的單克隆細(xì)胞株,經(jīng)無血清馴化培養(yǎng)獲得懸浮生長的細(xì)胞株。收集發(fā)酵培養(yǎng)上清,通過離心、過濾及親和層析等方法對目的蛋白GLP-1-Fc進(jìn)行分離純化,并利用Dot blot、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳、高效液相色譜法、Edman降解等方法進(jìn)行目的蛋白的質(zhì)量分析,以建立GLP-1-Fc融合蛋白發(fā)酵、純化工藝,探索該融合蛋白的質(zhì)量檢測方法。本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了表達(dá)GLP-1-Fc融合蛋白的重組DG44懸浮型細(xì)胞株,通過該工藝流程,GLP-1-Fc融合蛋白表達(dá)量達(dá)到400 mg/L,純度達(dá)95%,分子量約為3.0×10~4。該生產(chǎn)工藝能夠獲得與理論目標(biāo)蛋白相一致的、且結(jié)構(gòu)穩(wěn)定GLP-1-Fc融合蛋白,其質(zhì)量檢測方法穩(wěn)定可靠。
[Abstract]:The eukaryotic expression vector of GLP-1-Fc protein was constructed and expressed in DG44 cell line. The recombinant DG44 cell line expressing GLP-1-Fc fusion protein was constructed by genetic engineering, and the monoclonal cell lines with high expression were selected by pressure screening of methotrexate and limited dilution method. The suspension growth cell lines were obtained by serum-free acclimation culture. The supernatant of fermentation culture was collected and purified by centrifugation, filtration and affinity chromatography. The target protein GLP-1-Fc was separated and purified by Dot blot, sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis and high performance liquid chromatography (HPLC). Edman degradation and other methods were used to analyze the quality of the target protein in order to establish the fermentation and purification process of the GLP-1-Fc fusion protein and to explore the quality detection method of the fusion protein. The recombinant DG44 suspension cell line expressing GLP-1-Fc fusion protein was successfully constructed in this experiment. Through this process, the purity of GLP-1-Fc fusion protein was up to 400 mg/L, and the molecular weight was about 3.0 脳 10 ~ 4. The purity of GLP-1-Fc fusion protein reached 95% and the molecular weight was about 3.0 脳 10 ~ 4. The GLP-1-Fc fusion protein with stable structure and consistent with the theoretical target protein can be obtained by this process, and its quality detection method is stable and reliable.
【作者單位】： 南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院;上海凱茂生物醫(yī)藥有限公司;南京匯科生物工程設(shè)備有限公司;
【基金】：國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃(863計劃)(2012AA021201)
【分類號】：R915

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