【摘要】：細(xì)菌耐藥性已經(jīng)成為全球性問題,人類面臨“后抗生素時代”威脅�？s酚酸肽化合物是一類包含酯鍵的多肽,是由羥基酸和氨基酸由酯鍵和酰胺鍵連接構(gòu)成的一類寡聚物。具有抗菌、抗病毒、抗血栓、抗蟲以及抗腫瘤等多種生物活性。其中�；s酚酸肽(α-cyldepsipetide,ADEP)作為一種新型抗菌肽,對耐藥菌有其獨特的抗性機(jī)制,其作用靶點是高度保守的細(xì)菌酪蛋白水解激酶(caseinolytic kinase,Clp P),ADEP通過結(jié)合Clp P,使細(xì)菌蛋白質(zhì)水解不受調(diào)控,最終導(dǎo)致細(xì)菌死亡。Enopeptin A為ADEP家族的一員,具有抗病毒和抗包括耐甲氧西林-金黃色葡萄球菌在內(nèi)的革蘭氏陽性菌以及細(xì)胞膜缺陷的革蘭氏陰性突變體。近年來,科學(xué)家通過化學(xué)合成的方法對Enopeptin進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾,獲得的衍生物抗耐藥菌活性得到大幅提升。本文通過對Enopeptin A發(fā)酵及分離純化工藝的研究,為該品種進(jìn)行后續(xù)的結(jié)構(gòu)修飾改造、構(gòu)效關(guān)系的研究、以及新衍生物的開發(fā)奠定基礎(chǔ),以期最終獲得具有抗病毒和抗耐藥菌雙重效果的新藥物。本課題對化合物Enopeptin A的研究與開發(fā)具有一定的原創(chuàng)性和實用價值。論文針對目標(biāo)產(chǎn)物Enopeptin A建立了紫外-可見分光光度含量分析檢測法及HPLC分析檢測法。紫外-可見分光光度法的檢測波長為375 nm;HPLC的色譜條件為:色譜柱:Hypersil ODS2(250×4.6 mm,5μm);流動相:乙腈-1‰甲酸水(50:50);流速:1.0 m L/min;檢測波長:375 nm;柱溫:40℃;進(jìn)樣量20μL。原始菌株SIIA-H7264(110μg/m L)通過紫外線、NTG、EMS以及常壓室溫等離子體等理化誘變選育,得到高產(chǎn)穩(wěn)定的突變株A-21(440μg/m L)。設(shè)計優(yōu)化了種子工藝、發(fā)酵控制條件,并經(jīng)單因素篩選及響應(yīng)面法試驗,獲得最適發(fā)酵培養(yǎng)基配方,其組成為:葡萄糖2%,糊精8.85%,黃豆粉3%,硝酸鉀0.74%,氯化鈉0.2%,磷酸二氫鉀0.1%,碳酸鈣0.2%,p H 7.5。最佳發(fā)酵條件:接種量3%,培養(yǎng)溫度28℃,250 m L搖瓶培養(yǎng)基裝量為20 m L,搖床轉(zhuǎn)速220 r/min,發(fā)酵周期138h。在該條件下,Enopeptin A的產(chǎn)量達(dá)到1750μg/m L,相較于對照發(fā)酵產(chǎn)量440μg/m L,提高了2.98倍,比文獻(xiàn)報道的Enopeptin A的產(chǎn)量150μg/m L提高了10.67倍。對Enopeptin A的分離純化工藝進(jìn)行了研究開發(fā),通過溶媒萃取及層析工藝,包括填料、層析系統(tǒng)等參數(shù)的研究,最終確定發(fā)酵液濾液和菌絲體分別采用大孔吸附樹脂層析及溶媒萃取進(jìn)行Enopeptin A的粗制分離,后結(jié)合正相硅膠和反相硅膠多步層析的精制工藝路線,該提取工藝成本較低,并有效減少了有毒有機(jī)溶劑的使用,最終獲得的Enopeptin A產(chǎn)品HPLC純度達(dá)到95.0%以上,提取總收率達(dá)44%,開發(fā)了一條適宜于樣品放大制備的提取工藝路線。
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【學(xué)位授予單位】：成都學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R915

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2450443