【摘要】：1. TRAIL-NC1和TRAIL-TD融合蛋白的設(shè)計(jì)與復(fù)性 腫瘤壞死因子(TNF)相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體(TNF related apoptosis-inducing ligand, TRAIL)是TNF超家族的一員,由于其能選擇性殺傷腫瘤細(xì)胞而對(duì)正常細(xì)胞無害而被視為有潛力的抗腫瘤蛋白藥物。TRAIL能通過與腫瘤細(xì)胞細(xì)胞表面的死亡受體結(jié)合,從胞外途徑傳遞死亡信號(hào),最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。然而,目前常見的一些重組TRAIL均存在同樣的問題：不穩(wěn)定和半衰期短。 為了克服這些問題,研究者們制備了許多帶標(biāo)簽的重組TRAIL融合蛋白,如His-TRAIL, Flag-TRAIL, LZ-TRAIL和iLZ-TRAIL,旨在增強(qiáng)TRAIL的穩(wěn)定性和活性,另外也是為了純化方便的考慮。遺憾的是,雖然這些TRAIL融合蛋白表現(xiàn)出極強(qiáng)的腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡能力,同時(shí)卻也引起了肝毒性。由于帶有外源標(biāo)簽的TRAIL同時(shí)帶有毒副作用,因此有研究者采用內(nèi)源的融合片段(human pulmonary surfactant-associated protein D)來制備具有雙重功能和更高凋亡活性的TRAIL融合蛋白。綜上,尋找內(nèi)源性雙功能片段作為TRAIL的融合伴侶,有望解決TRAIL半衰期短、穩(wěn)定性差和肝毒性等缺點(diǎn)。 在本章節(jié)中,我們利用來源于人膠原蛋白ⅩⅤⅢ的NC1和NC1中的三聚域(TD),設(shè)計(jì)了兩種全新的TRAIL融合蛋白：TRAIL-NC1和TRAIL-TD,并且在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)。由于兩種融合蛋白都以不溶的包涵體形式存在于大腸桿菌中,且傳統(tǒng)的復(fù)性方法難以對(duì)它們進(jìn)行成功復(fù)性,因此我們開發(fā)了新的復(fù)性方法——兩步復(fù)性法,它結(jié)合了稀釋復(fù)性和凝膠過濾法柱上復(fù)性的優(yōu)點(diǎn),分步復(fù)性融合蛋白,最終成功復(fù)性了TRAIL-NC1融合蛋白。 分子排阻色譜分析TRAIL-NC1融合蛋白表明它的存在形式為三聚體,而TRAIL-TD融合蛋白為六聚體。TRAIL-NCI融合蛋白的誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡活性與同樣方法復(fù)性后的TRAIL (114-281)相同,然而大大弱于可溶性的TRAIL(114-281)(活性強(qiáng)50倍左右),仍未滿足最初設(shè)計(jì)TRAIL-NC1的要求。因此,本章節(jié)最主要的貢獻(xiàn)為開發(fā)了新的兩步復(fù)性法,豐富了蛋白質(zhì)復(fù)性領(lǐng)域的方法,對(duì)于TRAIL存在的缺點(diǎn),仍需繼續(xù)設(shè)計(jì)不同的解決方案。 2. TRAIL-vcMMAE的設(shè)計(jì)與抗腫瘤活性研究 TRAIL三聚體通過與細(xì)胞表面的死亡受體DR4和DR5結(jié)合傳遞死亡信號(hào),從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。誘捕受體(DcR1和DcR2)和可溶性受體(OPG)由于只含有部分或不含死亡域(death domain, DD)而不能傳遞TRAIL的凋亡信號(hào)。然而,仍然存在一些腫瘤細(xì)胞,其細(xì)胞表面表達(dá)DR4和DR5,卻仍然對(duì)TRAIL耐受,比如許多乳腺癌細(xì)胞系和黑色素瘤細(xì)胞系。研究者們認(rèn)為細(xì)胞內(nèi)TRAIL信號(hào)通路上一些事件導(dǎo)致了上述現(xiàn)象,例如FADD和caspase8存在缺陷、cFLIP過表達(dá)等原因。TRAIL可以通過與死亡受體結(jié)合被細(xì)胞內(nèi)吞,同時(shí)該內(nèi)吞行為并不是TRAIL誘導(dǎo)凋亡所必需的。因此,為了克服表面表達(dá)有DR4和DR5死亡受體的腫瘤細(xì)胞對(duì)TRAIL的耐受性,我們利用這一內(nèi)吞過程來使TRAIL通過化學(xué)偶聯(lián)攜帶劇毒小分子藥物進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),細(xì)胞內(nèi)溶酶體中的多種蛋白酶能夠水解偶聯(lián)物從而釋放出劇毒小分子,以另外的途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。 我們選擇了海兔毒素衍生物MMAE用于偶聯(lián)TRAIL,它們通過一個(gè)二肽(valine-citrulline,vc) linker相連接。MMAE是一種人工合成的有絲分裂抑制劑,它能通過抑制微管蛋白二聚化阻滯細(xì)胞分裂,從而使細(xì)胞凋亡。vcMMAE是一個(gè)在細(xì)胞外穩(wěn)定的系統(tǒng),而當(dāng)它進(jìn)入細(xì)胞后,可經(jīng)溶酶體中組織蛋白酶B的水解,釋放出MMAE,發(fā)揮抑制有絲分裂的機(jī)制。 在本章的研究中,我們?cè)O(shè)計(jì)了兩種TRAIL(95-281)突變體(S96C和N109C)用于偶聯(lián)vcMMAE,并且從體外活性實(shí)驗(yàn)中選出活性更優(yōu)的N109C-vcMMAE進(jìn)行后續(xù)的研究。后續(xù)的實(shí)驗(yàn)表明N109C-vcMMAE在腫瘤細(xì)胞攝取、死亡受體親和力、內(nèi)吞、體內(nèi)靶向等方面有良好的表現(xiàn),初步證實(shí)了TRAIL-MMAE偶聯(lián)物在抗腫瘤方面的可行性,進(jìn)而拓寬了抗體偶聯(lián)藥物(ADC)的覆蓋范圍,使TRAIL能夠替代抗體成為ADC中的“靶向彈頭”部分。 3.一種突變Cys位點(diǎn)特異性PEG修飾TRAIL的方法及其產(chǎn)物的抗腫瘤活性研究 在小鼠腫瘤移植模型中,無論是TRAIL單獨(dú)用藥還是與化療藥物聯(lián)用,都展現(xiàn)出顯著的抗腫瘤效果。然而,在2011年,Amgen和Genentech先后將TRAIL(產(chǎn)品名：Dulanermin)從公司產(chǎn)品線上撤下,且未發(fā)布具體緣由。可推測的是TRAIL本身的一些缺點(diǎn)制約了其在臨床上的進(jìn)一步進(jìn)展,比如：半衰期短、穩(wěn)定性差和潛在肝毒性。Polyethylene glycol (PEG)是一種生物相容性極佳的高分子聚合物,PEG修飾也被公認(rèn)為是最成功的蛋白修飾方式之一,經(jīng)過PEG修飾的蛋白具有更長的半衰期、更好的穩(wěn)定性以及更低的免疫原性。美國食品藥物監(jiān)督管理局(American Food and Drug Administration, FDA)至今已批準(zhǔn)了諸多經(jīng)PEG修飾的蛋白藥物和酶類,比如,用于治療急性淋巴細(xì)胞白血病和其他淋巴瘤的PEG-天冬酰胺酶(商品名：Oncaspar),用于治療急性聯(lián)合免疫缺陷癥的PEG腺苷脫氨酶(商品名：Adagen)。因此,研究者利用PEG修飾來改善TRAIL的藥代動(dòng)力學(xué)特性和穩(wěn)定性也就是意料之中的事情了。由于N端的氨基比側(cè)鏈氨基殘基具有更小的pKa值,只要控制反應(yīng)條件就能實(shí)現(xiàn)特異性地跟N端氨基的反應(yīng),因此之前的研究者們均采用N端特異性PEG修飾的方法。但是該方法所需時(shí)間較長、效率較低,因此需要我們找到一種更為簡便、高效的PEG修飾TRAIL的方式。 在本章中,我們描述了一種新型PEG-TRAIL的制備、分析和活性評(píng)價(jià)過程,它為在突變Cys位點(diǎn)進(jìn)行PEG修飾的TRAIL (95-281)突變體。我們選擇單甲基化聚(乙二醇)馬來酰亞胺(mPEG-MAL)用于修飾TRAIL,因?yàn)轳R來酰亞胺基團(tuán)能快速與TRAIL突變體上還原后的半胱氨酸巰基(Cys-SH)反應(yīng)生成硫醚鍵。我們選擇N109C作為反應(yīng)的TRAIL(95-281)突變體,原因在于N109C突變了一個(gè)潛在的N-糖基化位點(diǎn)(Asn-109)且在第三章中成功偶聯(lián)了MMAE,并展現(xiàn)出很好的抗腫瘤活性。在本章的研究中,我們?cè)谕蛔僀ys-SH定點(diǎn)PEG修飾TRAIL(95-281)突變體N109C (mPEGMAL-N109C)的體內(nèi)外活性、穩(wěn)定性、藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)等方面進(jìn)行了深入研究。同時(shí),我們構(gòu)建了N-端直接特異性PEG修飾的TRAIL(114-281)(mPEGALD-TRAIL114-281),用于與mPEGMAL-N109C比較,作為傳統(tǒng)PEG定點(diǎn)修飾方式的對(duì)照。結(jié)果顯示,相比野生型TRAIL(114-281)和mPEGALD-TRAIL114-281,mPEGMAL-N109C表現(xiàn)出更高的體內(nèi)抗腫瘤活性、更好的穩(wěn)定性、更長的半衰期,同時(shí)沒有檢測到任何的肝腎毒性,表明突變Cys位點(diǎn)的特異性PEG修飾可以成為修飾TRAIL一種更好選擇。
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【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R91;R96
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本文編號(hào)：2449873