【摘要】：糖尿病視網(wǎng)膜病變(Diabetic Retinopathy, DR)是2型糖尿病最常見的并發(fā)癥,目前已成為最主要的致盲眼病之一。DR的發(fā)生機制尚未明確,目前認為氧化應激是其中的一個關鍵環(huán)節(jié)。本研究通過體外實驗分別探討了左卡尼汀(L-Carnitine, LC)及褐藻酸寡糖抗氧化應激的神經(jīng)保護作用。首先考察了糖尿病及其并發(fā)癥(尤其是DR)患者血漿左卡尼汀、乙酰左卡尼汀(Acetyl-L-carnitine, ALC)和丙酰左卡尼汀(Propionyl-L-carnitine, PLC)的含量變化；通過建立高糖誘導的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞(Retinal ganglion cells. RGCs)凋亡模型,觀察高糖狀態(tài)下RGCs凋亡情況,探討LC和不同分子量甘露糖醛酸對高糖狀態(tài)下RGCs凋亡的保護作用及抗氧化機制；著重研究了LC對Nrf2-Keap1-ARE通路的調(diào)控作用；最后,對兩種組分的協(xié)同作用進行評價。(J)非干預收集健康志愿者(76例)、2型糖尿病患者(59例)以及糖尿病并發(fā)癥患者(糖尿病視網(wǎng)膜病變74例、早期糖尿病腎病51例、糖尿病周圍神經(jīng)病變57例、糖尿病高血壓69例、糖尿病性冠心病64例)的臨床指標及血漿樣本,采用柱前衍生熒光HPLC法檢測LC、ALC和PLC的含量。結果表明糖尿病組的血漿LC濃度明顯低于正常對照組(P0.05),其他并發(fā)癥組LC濃度又明顯低于糖尿病組(P0.05),但各并發(fā)癥組間比較無明顯差異(P0.05)。結果提示對于糖尿病患者,尤其是糖尿病并發(fā)癥患者來說,補充LC可能是有益的。(2)高糖狀態(tài)下,LC對高糖狀態(tài)下RGCs凋亡的保護作用及其抗氧化機制。原代培養(yǎng)RGCs,根據(jù)臺盼藍拒染實驗觀察細胞的存活情況,最終選擇30mmol·L-1葡萄糖濃度干預48 h,建立高糖模型；MTT法測定細胞活力提示以50-200μmol·L-1 LC促細胞活性作用最佳：Hoechst33342染色結果顯示不同濃度LC組細胞凋亡率明顯低于高糖損傷組(P0.01或P0.05),提示LC能夠抑制高糖所致的RGCs凋亡。LC組活性氧(Reactive oxygen species, ROS)、丙二醛(Malondialdehyde, MDA)水平較高糖損傷組顯著下降(P0.01或P0.05),而超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase, SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase, GSH-Px)和過氧化氫酶(Catalase, CAT)活性以及總抗氧化能力(Totalanti-oxidation capability, T-AOC)與模型組相比較顯著升高(P0.01或P0.05),且效應呈劑量依賴性。結果提示LC可通過增強細胞的抗氧化能力抑制高糖所致的細胞凋亡。(3)高糖狀態(tài)下,LC對RGCs凋亡過程中Nrf2-Keapl-ARE通路的調(diào)控作用。結果顯示LC組Nrf2蛋白表達比高糖組顯著增多(P0.01或P0.05)：而Keapl蛋白表達與高糖組比較無顯著性差異(P0.05),血紅素加氧酶(HO-1)和γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)的蛋白表達均比高糖組顯著增強(P0.01),且呈劑量依賴性,提示LC可能通過激活Nrf2-Keapl-ARE通路,增加下游抗氧化物酶HO-1和Ⅱ相解毒酶γ-GCS的表達,進而對高糖狀態(tài)下RGCs的氧化應激性損傷發(fā)揮保護作用。(4)在課題組前期鑒定出甘露糖醛酸M段的四個組分(MH-1、MH-2、 MH-3、MH-4)的基礎上,探討不同分子量的甘露糖醛酸預處理對細胞活性的影響。結果顯示,在10-1000μg·ml-1范圍內(nèi)不同分子量的甘露糖醛酸可拮抗高糖對RGCs凋亡的影響(P0.01)。Hoechst33342染色顯示不同分子量甘露糖醛酸均能夠抑制高糖損傷所致的RGCs凋亡,其在濃度為100μg·ml-1時的保護作用排序為MH-1MH-2MH-4MH-3;不同分子量甘露糖醛酸組ROS水平較高糖組顯著下降(P0.01),均能逆轉高糖引起的MDA的升高(P0.01),減輕脂質(zhì)過氧化,抗氧化酶SOD、GSH-PX和CAT活性以及T-AOC與高糖組相比均顯著升高(P0.05)。結果提示不同分子量甘露糖醛酸可通過增強細胞的抗氧化能力抑制高糖所致的細胞凋亡。(5)探討左卡尼汀與甘露糖醛酸寡糖對高糖誘導RGCs凋亡的協(xié)同保護作用。選擇對RGCs凋亡保護作用最強的MH-1三個濃度分別與LC混合,Hoechst33342染色檢測細胞凋亡發(fā)現(xiàn)現(xiàn)在相同條件下,甘露糖醛酸寡糖MH-1段對RGCs凋亡的保護作用略低于左卡尼汀。三組混合組凋亡率比較發(fā)現(xiàn),低濃度混合組對RGCs凋亡的保護作用高于低濃度LC組,又高于低濃度MH-1組和中濃度MH-1組,中濃度混合組對RGCs凋亡的保護作用高于MH-1 (M)組,與LC(M)無顯著性差異,高濃度混合組對RGCs凋亡的保護作用高于MH-1(H)組,與LC(H)組無顯著性差異,LC和甘露糖醛酸寡糖低、中、高濃度聯(lián)合組的CDI (The coefficient of drug interaction)分別為0.598,、0.971、1.350。說明左卡尼汀與甘露糖醛酸寡糖混合作用于高糖誘導的RGCs凋亡具有協(xié)同增效的作用。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：中國海洋大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R96

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本文編號：2449644