【摘要】：乳腺癌是導(dǎo)致婦女癌癥死亡的第二大原因。乳腺癌中發(fā)生乳腺癌易感基因1(breast cancer susceptibility gene,BRCA1)和BRCA2基因突變的攜帶者高達(dá)45-80%,且存活率非常低。目前臨床上尚無(wú)根治BRCA基因突變型乳腺癌的有效療法,所以有效治療藥物的研發(fā)極為迫切。BRCA1和BRCA2基因在細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中對(duì)維持基因組的穩(wěn)定性起著重要作用,其突變與乳腺癌發(fā)病高度相關(guān)。聚腺苷酸二磷酸核糖聚合酶(poly(ADP-ribose)polymerase,PARP)是存在于真核細(xì)胞的參與DNA修復(fù)的核酶,主要與堿基切除修復(fù)(base excision repair,BER)中的DNA單鏈損傷修復(fù)密切相關(guān)。當(dāng)它被抑制時(shí),因BER缺陷會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生大量不能及時(shí)修復(fù)的DNA單鏈損傷,從而產(chǎn)生大量DNA雙鏈損傷(double strand breaks,DSB)。這些DNA雙鏈損傷在正常細(xì)胞內(nèi)可以通過(guò)BRCA1/2等因子共同參與介導(dǎo)的高保真同源重組(homologous recombination,HR)途徑得到修復(fù);而在BRCA基因缺陷的腫瘤細(xì)胞內(nèi),由于缺少HR修復(fù)途徑,造成DSB不能修復(fù)或者由容易出錯(cuò)的非同源重組末端連接(non-homologous end joining,NHEJ)修復(fù),從而大大增加了BRCA缺陷的腫瘤細(xì)胞的死亡概率,稱為協(xié)同致死作用。PARP抑制劑正是通過(guò)上述的協(xié)同致死作用對(duì)BRCA基因缺陷的卵巢癌和乳腺癌發(fā)揮藥理作用的。本研究對(duì)前期篩選獲得的在酶水平具有較強(qiáng)PARP抑制活性的26個(gè)新結(jié)構(gòu)化合物(AZD2281的類似物)進(jìn)一步進(jìn)行體內(nèi)和體外抗腫瘤活性的篩選與評(píng)價(jià),并對(duì)其抗腫瘤作用的特點(diǎn)和機(jī)制進(jìn)行探索,旨在獲得對(duì)BRCA突變?nèi)橄侔┚哂休^好治療前景的PARP抑制劑提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。一、PARP抑制劑的體外抗腫瘤活性篩選與評(píng)價(jià)本部分通過(guò)觀察PARP抑制劑單用對(duì)BRCA突變腫瘤細(xì)胞的藥效以及與DNA烷化劑替莫唑胺合用對(duì)BRCA非突變腫瘤細(xì)胞的藥效,從26個(gè)新結(jié)構(gòu)化合物中篩選活性較好的化合物進(jìn)行后續(xù)的篩選與評(píng)價(jià)。1.PARP抑制劑單用對(duì)BRCA突變腫瘤細(xì)胞的影響本部分通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞活力及凋亡考察PARP抑制劑單用對(duì)BRCA突變腫瘤細(xì)胞的影響,篩選活性較好的化合物。1.1 PARP抑制劑單用對(duì)BRCA突變腫瘤細(xì)胞增殖的影響選用人源BRCA突變的乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-436細(xì)胞,采用CCK-8法檢測(cè)26個(gè)受試化合物與已上市的PARP抑制劑奧拉帕尼(Olaparib/AZD2281,Lynparza)單獨(dú)使用時(shí)的細(xì)胞存活的影響。結(jié)果表明,XML120104-C(化合物5)、XML12021502(化合物7)、XML12022901(化合物13)和XML12032104(化合物19)等15個(gè)化合物可顯著抑制MDA-MB-436細(xì)胞的增殖,IC50在15-70μM之間,與陽(yáng)性藥AZD2281的作用強(qiáng)度接近。1.2.PARP抑制劑單用對(duì)BRCA突變腫瘤細(xì)胞凋亡的影響采用BRCA突變的乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-436細(xì)胞,通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)觀察了上述15個(gè)具有較強(qiáng)體外抑瘤作用的PARP抑制劑對(duì)細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),XML120104-C(化合物5)、XML12021502(化合物7)等9個(gè)化合物能不同程度地增高細(xì)胞晚期凋亡率,且具有明顯濃度依賴性,提示它們具有誘導(dǎo)晚期細(xì)胞凋亡作用。2.PARP抑制劑與替莫唑胺合用對(duì)非BRCA突變腫瘤細(xì)胞增殖的影響采用CCK-8法觀察了受試化合物與烷化劑類抗腫瘤藥物替莫唑胺合用時(shí)對(duì)人源的肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞活力的影響。研究發(fā)現(xiàn),XML120104-C(化合物5)、XML12021502(化合物7)等7個(gè)化合物與替莫唑胺合用具有一定的增效作用。綜合考慮化合物單用與合用的結(jié)果以及結(jié)構(gòu)多樣性和成藥的難易程度等因素,本研究進(jìn)而選擇體外抗腫瘤活性較好的化合物5和化合物19,在整體動(dòng)物水平初步評(píng)價(jià)了它們的抗腫瘤活性。二、PARP抑制劑體內(nèi)抗腫瘤活性評(píng)價(jià)本部分選擇PARP抑制劑XML120104-C(化合物5)和XML12032104(化合物19),在人源BRCA突變的乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-436移植瘤模型上,評(píng)價(jià)它們的體內(nèi)抗腫瘤活性。首先建立BALB/C裸小鼠乳腺癌異種移植瘤模型,進(jìn)而觀察灌胃給予PARP抑制劑23天對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),給藥23天后陽(yáng)性對(duì)照藥AZD2281(50mg/kg)和受試化合物5(50mg/kg)及化合物19(50mg/kg)都能明顯抑制荷瘤小鼠腫瘤的生長(zhǎng),抑瘤率分別為80.6%、73.6%、88.8%。各給藥組腫瘤體積均明顯小于溶劑對(duì)照組,且體重?zé)o明顯下降,腫瘤也無(wú)轉(zhuǎn)移。結(jié)果提示,化合物5和化合物19在整體動(dòng)物水平對(duì)BRCA突變的乳腺癌具有明顯抑制作用。三、PARP抑制劑的作用機(jī)理研究本部分主要通過(guò)考察PARP抑制劑對(duì)BRCA突變及非突變腫瘤細(xì)胞的作用差異,研究PARP抑制劑通過(guò)協(xié)同致死作用發(fā)揮抗腫瘤藥效的作用機(jī)制。1.PARP抑制劑對(duì)BRCA突變及非突變腫瘤細(xì)胞增殖的影響采用CCK-8法觀察篩選獲得的4個(gè)高活性化合物5、7、13、19對(duì)人源的BRCA突變?nèi)橄侔┘?xì)胞系MDA-MB-436及BRCA非突變?nèi)巳橄侔┘?xì)胞系MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞增殖的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn),四個(gè)化合物對(duì)MDA-MB-436細(xì)胞具有選擇性抑制作用,而對(duì)MDA-MB-231、MCF-7細(xì)胞的增殖抑制作用較弱。提示4個(gè)化合物對(duì)BRCA突變細(xì)胞的抑制作用均強(qiáng)于其對(duì)于非BRCA突變細(xì)胞的抑制作用,提示它們?cè)诳笲RCA突變?nèi)橄侔┲芯哂羞M(jìn)一步研究的價(jià)值。2.PARP抑制劑對(duì)BRCA突變及非突變腫瘤細(xì)胞凋亡的影響進(jìn)一步采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)4個(gè)化合物對(duì)人BRCA突變的乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-436和BRCA非突變?nèi)巳橄侔┘?xì)胞系MCF-7細(xì)胞凋亡的影響。研究結(jié)果表明,化合物5、7、19能夠明顯誘導(dǎo)MDA-MB-436細(xì)胞晚期凋亡,且呈濃度依賴性,100μM細(xì)胞凋亡率高達(dá)80%左右。而PARP抑制劑1~100μM在MCF-7細(xì)胞凋亡率都不到25%。化合物13對(duì)兩種細(xì)胞凋亡都沒(méi)有明顯影響。提示上述3個(gè)化合物能夠通過(guò)選擇性誘導(dǎo)BRCA突變細(xì)胞凋亡發(fā)揮抗腫瘤作用,這可能是它們選擇性抑制BRCA突變細(xì)胞增殖的重要機(jī)制之一。3.PARP抑制劑對(duì)BRCA突變及非突變腫瘤細(xì)胞周期的影響采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)化合物5、7、13、19對(duì)人源的BRCA突變的乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-436細(xì)胞和BRCA非突變?nèi)巳橄侔┘?xì)胞系MCF-7細(xì)胞周期的影響。結(jié)果顯示,化合物5、7、19能濃度依賴性誘導(dǎo)MDA-MB-436和MCF-7細(xì)胞周期阻滯在G2期和S期�；衔�13對(duì)兩種細(xì)胞周期都沒(méi)有明顯影響。提示化合物5、7、19可能通過(guò)將腫瘤細(xì)胞阻滯在G2期和S期發(fā)揮抗腫瘤作用,但對(duì)BRCA突變及非突變腫瘤細(xì)胞無(wú)選擇性。4.PARP抑制劑對(duì)BRCA突變細(xì)胞中PAR蛋白表達(dá)的影響ADP核糖聚合物(poly(ADP-ribose),PAR)蛋白含量是反映DNA損傷修復(fù)程度的重要指標(biāo)。采用Western blotting檢測(cè)化合物5、7、13、19對(duì)人源的BRCA突變的乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-436細(xì)胞中PAR蛋白的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),隨著PARP抑制劑(化合物5、7、19)濃度的升高,PAR的表達(dá)量呈逐漸降低趨勢(shì)。化合物13對(duì)PAR蛋白的表達(dá)無(wú)明顯影響。提示化合物5、7、19可能通過(guò)抑制PAR蛋白的表達(dá),致使腫瘤細(xì)胞的DNA損傷修復(fù)減少,從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。綜上所述,本論文可以得出以下結(jié)論:1.在26個(gè)分子水平抑酶活性較好的PARP抑制劑中,XML120104-C(化合物5)、XML12021502(化合物7)和XML12032104(化合物19)可選擇性抑制BRCA突變的乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-436細(xì)胞的增殖,并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,并呈濃度依賴性。2.PARP抑制劑XML120104-C(化合物5)和XML12032104(化合物19)能夠顯著抑制BRCA突變的乳腺癌異種移植瘤小鼠腫瘤的生長(zhǎng),其作用強(qiáng)度與AZD2281接近。3.PARP抑制劑單用對(duì)BRCA突變的腫瘤細(xì)胞具有選擇性抑制作用,其作用機(jī)制可能包括:(1)可選擇性誘導(dǎo)BRCA突變腫瘤細(xì)胞的晚期凋亡;(2)可非選擇性地將腫瘤細(xì)胞阻滯在G2和S期;(3)可能通過(guò)抑制PAR蛋白的表達(dá)使腫瘤細(xì)胞的DNA損傷修復(fù)減少,從而促進(jìn)細(xì)胞死亡。綜上所述,本研究篩選獲得了XML120104-C(化合物5)和XML12032104(化合物19)等對(duì)BRCA突變的腫瘤細(xì)胞具有選擇性抑制作用的新PARP抑制劑,并發(fā)現(xiàn)化合物5和19在整體動(dòng)物水平對(duì)裸鼠BRCA突變的移植瘤具有顯著抑制作用。本研究發(fā)現(xiàn)化合物5等PARP抑制劑抗腫瘤作用的機(jī)制可能是與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、誘導(dǎo)細(xì)胞周期的阻滯、抑制PAR蛋白的表達(dá)進(jìn)而阻斷DNA損傷修復(fù)相關(guān)。
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【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R96

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 Yan Shi;Fang Zhou;Feng Jiang;Hong Lu;Jianjun Wang;Chuanyao Cheng;;PARP inhibitor reduces proliferation and increases apoptosis in breast cancer cells[J];Chinese Journal of Cancer Research;2014年02期

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本文編號(hào)：2444344