【摘要】：中樞神經系統(tǒng)(Central Nervous System,CNS)疾病，包括神經退行性疾病及腦部腫瘤等，嚴重危害人類健康。許多神經退行性病變與基因的異常表達有關，基因藥物具有分子靶點的高特異性特點。因此，針對CNS疾病治療，高效、準確的靶基因沉默技術具有很好的治療前景。 但是，由于血腦屏障（the blood brain barrier，BBB）的生理作用，包括基因藥物在內的大多數大分子藥物無法主動轉運跨越BBB至腦內，實現其有效治療作用。因此，構建通過非侵襲給藥途徑如鞘內注射，將基因藥物傳遞入腦的藥物載體系統(tǒng)至關重要。經載體的包封，可以有效降低血液中核酸酶的影響從而提高藥物穩(wěn)定性。此外，特異性配體修飾的非病毒載體，可通過靜脈給藥途徑實現載藥系統(tǒng)主動轉運透過BBB，將藥物遞送至腦內。 基于以上研究背景，本課題構建了一種新型的陽離子聚合物PEG-P[Asp(TEP)]-chole作為基因載體，制備PEG-P[Asp(TEP)]-chole/pDNA聚陽離子復合物（Polyplxe）。由于天冬氨酸為構成體內蛋白的基本氨基酸，所以生物相容性較好，載體的安全性得到提高。進而在聚陽離子復合物表面修飾了雙級靶向配體，由狂犬病毒糖蛋白衍生的多肽RVG29作為一級腦靶向配體，與BBB上的乙酰膽堿受體和γ-氨基丁酸受體特異性結合結合，以受體介導的內吞作用，實現主動靶向腦轉運。由Tet-1肽作為二級靶向配體與神經節(jié)苷脂GT1B受體特異性結合靶向于神經細胞。 第一部分，陽離子聚合物載體的合成及表征。 合成L-天冬氨酸-N-羧酸酐（BLA-NCA）單體，以BLA-NCA和聚乙二醇為原料合成PEG-PBLA嵌段聚合物。然后，對聚天冬氨酸鏈端進行氨基修飾，使PEG-PBLA呈正電性，可與帶負電的基因壓縮形成納米聚陽離子復合物。進一步將聚合物進行膽甾醇修飾，得到PEG-P[Asp(TEP)]-chole，聚合物的疏水性增加，有利于粒子的生物膜的透過性能及穩(wěn)定性提高。 配體的連接利用乙縮醛與多肽結構中半胱氨酸的巰基反應。在醋酸緩沖液為介質的酸性環(huán)境中，PEG末端的乙縮醛基水解為醛基，與含有半胱氨酸的多肽Tet1或RVG29反應，得到經配體修飾的聚合物Tet1-PEG-P[Asp(TEP)]-chole或者RVG29-PEG-P[Asp(TEP)]-chole。通過核磁氫譜進行結構分析，結果顯示，合成的終產物為PEG-P[Asp(TEP)]-chole，并且將多肽Tet1和RVG29修飾于PEG-P[Asp(TEP)]-chole之上。 第二部分，聚離子基因復合物的制備及表征。 制備不同N/P比的載重組質粒復合物，測定其粒徑、Zeta電位并通過凝膠電泳考察其基因復合能力。結果顯示，隨N/P的增加，粒徑逐漸減小，至150nm以下，當N/P比為12以上時，粒徑約100nm，有利于聚陽離子復合物透過BBB。Zeta電位結果顯示，隨N/P的增加，正電性逐漸增加，N/P比等于16時，Zeta電位約+15mV。凝膠電泳顯示，隨N/P比的增加，游離pDNA的條帶逐漸變淺，N/P比12時，條帶完全消失。說明隨著表面的正電荷逐漸增加，載體對pDNA的包封能力逐漸提高，而正電性的提高既有利于透過BBB（BBB內皮細胞帶負電性），此外能夠提高轉染效率。 第三部分，聚離子基因復合物的細胞及組織毒性考察。 采用MTT法，以常用的轉染試劑Lipofectamin-2000為陽性對照考察不同N/P比的聚陽離子復合物對bEnd.3細胞和Neuro-2a細胞的毒性。結果顯示，不同N/P制備的復合物給藥后，兩種細胞生存率均在85%以上，而Lipofectamin-2000對照組的細胞生存率小于80%。結果表明，與lipofectamine-2000相比，PEG-P[Asp (TEP)]-chole具有較小的細胞毒性。CD68免疫組化考察PEG-P[Asp (TEP)]-chole的組織毒性。Balb/c小鼠尾靜脈給藥7d后，分別于24h和72h觀察主要器官中陽性細胞數量。結果顯示，給藥24h后腎臟、肺、脾有少量的炎性細胞，其它組織與生理鹽水組相比，無顯著性差異。72h結果顯示，各組織中幾乎無陽性細胞，與生理鹽水組無顯著性差異。CD68免疫組化結果表明，PEG-P[Asp (TEP)]-chole對部分組織有一定的急性毒性，隨著時間延長可趨于正常。 第四部分，聚離子基因復合物的促內涵體逃逸及腦轉運特性考察。 通過細胞攝取、細胞內定位示蹤、跨細胞單層膜培養(yǎng)實驗評價基因遞藥系統(tǒng)的雙級腦靶向特性。將Cy3標記的pDNA包載于陽離子聚合物中，與bEnd.3細胞共孵育，結果顯示，RVG29/Tet1-polyplex能被bEnd.3細胞特異性攝取。流式細胞儀定量檢測不同配體修飾的polyplex，結果顯示，經RVG29修飾后細胞攝取率提高了19.3%。Neuro-2a細胞內定位示蹤實驗表明，polyplex被攝取進入神經細胞，定位于細胞核周圍，隨孵育時間的增加，polyplex能夠成功從內涵體中逃逸出來，進而實現基因的轉染。將pGFP和pGL3質粒分別包載于陽離子聚合物中，分別用于定性、定量分析。轉染定量結果顯示，Tet1-polyplex組轉染效率是未修飾組的3.3倍，雙配體修飾組在細胞中表現出最強的熒光強度，是未修飾組轉染效率的4.6倍。將bEnd.3和Neuro-2a共培養(yǎng)于細胞小室Transwell中，模擬BBB屏障，跨單層膜轉運實驗表明，Tet1/RVG29-polyplex相對于修飾單配體RVG29或者Tet-1能跨過轉運透過bEnd.3細胞單層膜，，靶向于Neuro-2a細胞，增加其攝取， Tet1/RVG29-polyplex的透膜率約是未修飾組的2倍。 采用小動物活體成像技術，評價所構建載體系統(tǒng)的體內分布，將熒光染料DiR包裹于不同配體修飾的PEG-P[Asp (TEP)]-chole，尾靜脈注射后，于一定時間點動物活體成像儀觀察體內熒光分布。結果表明，雙配體修飾的復合物相對于未修飾及分別修飾單配體的聚陽離子復合物具有更多的腦內分布，說明其實現了雙級靶向性，增加藥物的腦部轉運。 第五部分，聚離子基因復合物沉默BACE1基因。 通過將干擾RNA構建于質粒，將具有干擾作用的質粒包載于雙配體Tet1和RVG29修飾的陽離子聚合物載體中，能有效下調神經細胞Neuro-2a中的BACE1蛋白水平。 雙轉基因APP/PS1AD小鼠，尾靜脈注射polyplex后，Morris水迷宮評價小鼠的空間記憶能力，結果表明，polyplex經Tet1和RVG29多肽修飾后，小鼠的空間記憶能力顯著提高，說明polyplex-Tet1/RVG29是一種更為有效的腦內遞藥系統(tǒng)。 本課題合成了一種新型陽離子聚合物，將siRNA重組質粒復合其中，并進行了雙配體的修飾，構建了一種具有腦部基因傳遞作用的聚陽離子復合物，實驗結果顯示，該載體系統(tǒng)具有良好的腦靶向性，且毒性較低，是一種有潛力的非病毒基因載體。
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【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R96

【參考文獻】

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1 謝英,葉麗亞,張小濱,侯新樸,婁晉寧;血腦屏障體外實驗模型的建立[J];北京大學學報(醫(yī)學版);2004年04期

2 吳珍;杜士明;董永成;;納米粒作為腦靶向給藥系統(tǒng)的研究進展[J];中國藥房;2007年13期

3 郎軼詠;姜同英;王思玲;莫鳳奎;;喜樹堿/聚天冬氨酸衍生物-接枝-聚乙二醇共聚物膠束的制備及性質研究[J];中國現代藥物應用;2010年18期

本文編號：2436600