【摘要】：在藥物研發(fā)過程中,細(xì)胞水平測試是不可缺少的重要環(huán)節(jié)。傳統(tǒng)的孔板細(xì)胞平臺過于簡陋,只是使細(xì)胞靜態(tài)地暴露于藥物溶液中,忽略了細(xì)胞外微環(huán)境,更沒有涉及藥物在體內(nèi)吸收、分布、代謝和消除的特性,實驗結(jié)果可靠性極低,參考意義有限。微流控芯片內(nèi)單元構(gòu)件的尺度使它有可能同時容納分子,細(xì)胞,組織,甚至器官,而芯片特殊的流體精準(zhǔn)操控體系又使它能同時測量物理量,化學(xué)量和生物量,兼有體積小、消耗低、高通量等優(yōu)點,被視為取代孔板的理想平臺。目前已報道的用于藥物篩選的微流控裝置多為將不同組織來源的細(xì)胞進(jìn)行二維串、并聯(lián),尚未考慮藥物跨膜的過程,更沒有大量實際藥物測試數(shù)據(jù)支撐,仍處于概念階段。針對于已有藥物篩選芯片的不足,依據(jù)口服藥物的吸收代謝流程,本論文設(shè)計并構(gòu)建了一個立體多層(3D),集成多種細(xì)胞屏障(多元),具有多功能的微流控類器官藥物篩選芯片,用以在體外模擬藥物經(jīng)過口服后的吸收、分布、代謝和消除的過程。芯片從上至下依次集成了結(jié)腸癌細(xì)胞系(Caco-2)、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞系(HUVEC)、SD大鼠原代肝實質(zhì)細(xì)胞、HUVEC,人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7、SD大鼠心臟、肺、脂肪組織和透析膜,此排列順序依照藥物在腸道被腸上皮絨毛吸收后,穿過毛細(xì)血管進(jìn)入血液,由肝門靜脈匯入肝臟,經(jīng)心臟輸送至全身,跨出毛細(xì)血管到達(dá)各個組織,最后經(jīng)腎臟排出的過程而設(shè)置。論文第一部分描述了芯片的設(shè)計及構(gòu)建,并對可行性進(jìn)行了驗證。首先,分別考察了3D多元類器官芯片中各生物單元的功能。其次,利用熒光素鈉、普萘洛爾和葡聚糖的透過實驗,確立了Caco-2和HUVEC細(xì)胞層的功能性以及芯片的密封性。隨后,利用環(huán)磷酰胺驗證了SD大鼠肝實質(zhì)細(xì)胞層的代謝能力。最后,通過染色鑒定了芯片中心臟、肺和脂肪組織的活性維持。第二部分描述了3D多元類器官芯片在藥物研發(fā)中的應(yīng)用。包括普萘洛爾和戊巴比妥在心臟、肺和脂肪組織中的分布;環(huán)磷酰胺,紫杉醇、5-氟尿嘧啶和埃博霉素B對MCF-7細(xì)胞的抑制作用；對乙酰氨基酚、普萘洛爾、環(huán)磷酰胺、紫杉醇、5-氟尿嘧啶和埃博霉素B引發(fā)的肝細(xì)胞損傷；普萘洛爾、硫噴妥鈉、戊巴比妥和埃博霉素B在循環(huán)培養(yǎng)液中的濃度變化。多種經(jīng)典藥物的芯片測試結(jié)果與文獻(xiàn)報道的動物實驗結(jié)果具有相同的趨勢物,由此證明,相對于傳統(tǒng)細(xì)胞平臺,此基于微流控技術(shù)的多元3D芯片更適合于前期藥物篩選,其測試結(jié)果對隨后的體內(nèi)實驗具有一定的參考價值,可能有效提高藥物篩選的效率。第三部分對在3D多元類器官芯片測試中展現(xiàn)出優(yōu)秀抗腫瘤藥效的埃博霉素B的作用機制作了進(jìn)一步探討。實驗發(fā)現(xiàn),作為微管蛋白穩(wěn)定劑的埃博霉素B衍生物UTD1,在不同濃度下可使MCF-7和HT29細(xì)胞產(chǎn)生不同的狀態(tài)：高濃度(800 nM)的UTD1能阻止有絲分裂,使細(xì)胞停滯于G2/M期,此時p21和Bax蛋白水平無顯著變換,但P53蛋白水平上調(diào),且定位于細(xì)胞質(zhì)中,caspase 7酶原被激活,證明此時細(xì)胞凋亡機制啟動；而在較低濃度(50 nM)時,UTD1誘導(dǎo)MCF-7和HT29細(xì)胞形成非整倍體并產(chǎn)生細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期,細(xì)胞中檢測到p21蛋白水平上調(diào),而Bax和P53蛋白水平無顯著變化,但P53蛋白轉(zhuǎn)錄活性上調(diào),說明P53轉(zhuǎn)錄活性提高并不依賴于蛋白水平的積累；P53蛋白在相同藥物帶來的不同細(xì)胞壓力下發(fā)揮出截然相反的作用,促進(jìn)被阻滯于G2/M期的細(xì)胞凋亡,而嘗試維持被阻滯于Go/G1期的細(xì)胞存活,這對于癌癥的治療可能不利。本文設(shè)計并構(gòu)建的微流控3D多元類器官藥物篩選芯片,可用以在體外測試藥物的ADME特性、肝細(xì)胞毒性和抗腫瘤活性試驗,其結(jié)果與動物實驗具有相同趨勢的結(jié)果,完全優(yōu)于現(xiàn)有的細(xì)胞實驗平臺,證明了它所具有的用于藥物前期初篩的可行性和價值,為“人體芯片”最終完全取代替代細(xì)胞實驗提供了新的思路和新的數(shù)據(jù)支持；根據(jù)芯片試驗結(jié)果,進(jìn)一步研究埃博霉素B的抗腫瘤機制,提出并證明了不同程度的微管解聚紊亂導(dǎo)致P53蛋白做出的不同決策并產(chǎn)生截然相反的下游信號應(yīng)答,此結(jié)果有助于為進(jìn)一步了解P53蛋白及其相關(guān)復(fù)雜信號通路,并推測低濃度微管紊亂劑作用下P53蛋白可能會影響化療效果。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：大連理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R917

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本文編號：2435251