【摘要】：目的:研究澤瀉醇B 23-乙酸酯(alisol B 23-acetate,AB23A)的肝保護作用及其分子藥理學(xué)機制。方法:(1)澤瀉醇B 23-乙酸酯通過激活法尼醇X受體(farnesoid X receptor,FXR)促進小鼠部分肝切除后的肝再生作用。灌胃給予小鼠AB23A(12,5,25和50mg/kg)每日1次,連續(xù)7天。在第4、5、6、7天,行70%肝部分切除術(shù)或假手術(shù)。以肝臟比重、肝細胞增殖比率及有絲分裂指數(shù)評價AB23A促肝再生作用;測定細胞周期蛋白Cyclin D1,Cyclin B1及其上游叉頭轉(zhuǎn)錄因子M1b(forkhead box M1b,FoxM1b)的基因和蛋白表達,揭示AB23A促肝細胞增殖作用機制;以血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)及肝內(nèi)膽汁酸水平評價AB23A肝保護作用;測定膽汁酸合成限速酶Cyp7a1和膽汁酸外排轉(zhuǎn)運體Bsep表達變化,揭示AB23A降低肝內(nèi)膽汁酸水平的作用機制;采用FXR拮抗劑木苦甾酮(guggulsterone,GS)阻斷FXR信號通路,評價AB23A的體內(nèi)促肝再生及肝保護作用是否與激活FXR有關(guān);體外實驗采用小鼠原代肝細胞培養(yǎng),測定AB23A對FXR靶基因的誘導(dǎo)作用,并采用基因沉默實驗測定FXR基因沉默對AB23A誘導(dǎo)FXR靶基因作用的影響;采用雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炘u價AB23A對FXR的激活作用,以分子對接實驗?zāi)MAB23A與FXR的結(jié)合作用。(2)澤瀉醇B 23-乙酸酯通過調(diào)控FXR介導(dǎo)的膽汁酸轉(zhuǎn)運體和合成酶對ANIT所致小鼠肝損傷及膽汁淤積的保護作用。灌胃給予小鼠AB23A(10,20和40 mg/kg)每日1次,連續(xù)7天。在第5、6天給藥4小時后,灌胃給予ANIT(75 mg/kg)。以血清alt、ast、堿性磷酸酶(alp),γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(γ-gtp),總膽紅素,總膽汁酸、肝內(nèi)總膽汁酸、膽汁中總膽汁酸水平及肝組織病理學(xué)評價ab23a對anit所致肝損傷及膽汁淤積的保護作用;測定膽汁酸攝取轉(zhuǎn)運體ntcp、oatp1b2及外排轉(zhuǎn)運體bsep、mrp2、mdr2、mrp3、mrp4表達,揭示ab23a對肝內(nèi)膽汁酸轉(zhuǎn)運的作用機制;測定膽汁酸合成酶cyp7a1、cyp8b1、cyp27a1及膽汁酸結(jié)合酶bal、baat表達,揭示ab23a對膽汁酸合成及結(jié)合的作用機制;測定膽汁酸代謝酶cyp3a11、cyp2b10、sult2a1及ugt1a1表達,揭示ab23a對膽汁酸代謝的作用機制;采用fxr拮抗劑gs阻斷fxr信號通路,評價ab23a降低肝內(nèi)膽汁酸及肝保護作用是否與激活fxr有關(guān);雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烍w外評價ab23a對fxr的激活作用。(3)澤瀉醇b23-乙酸酯通過激活fxr和stat3對四氯化碳所致小鼠肝毒性的保護作用。以fxr激動劑cdca為陽性對照藥,灌胃給予小鼠ab23a(10,20和40mg/kg)每日1次,連續(xù)7天。在第5、6天給藥4小時后,腹腔注射給予ccl4(750μl/kg)。以血清alt、ast、總膽汁酸、肝組織病理學(xué)及tunel細胞凋亡分析,評價ab23a對ccl4所致小鼠肝毒性的保護作用;以brdu染色陽性肝細胞數(shù)及有絲分裂指數(shù)評價ab23a對肝細胞增殖的影響;測定foxm1b、cyclind1及cyclinb1表達,揭示ab23a促肝細胞增殖的作用機制;測定膽汁酸轉(zhuǎn)運體ntcp、bsep、mrp2及膽汁酸合成酶cyp7a1、cyp8b1表達,揭示ab23a降低肝內(nèi)膽汁酸水平的作用機制;測定p-stat3及stat3靶基因bcl-xl、socs3表達,揭示ab23a減少凋亡肝細胞的作用機制。(4)澤瀉醇b23-乙酸酯作用于fxr介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運體和酶對雌激素誘導(dǎo)小鼠膽汁淤積性肝損傷的保護作用。以fxr激動劑cdca為陽性對照藥,灌胃給予小鼠ab23a(7.5,15和30mg/kg)每日1次,連續(xù)7天。在第3天給藥4小時后,皮下注射給予10mg/kg的17α-炔雌醇(ee),每日1次,至第7天。以血清alp、總膽汁酸、膽汁流、膽汁中膽汁酸水平及肝組織病理學(xué)評價ab23a對ee誘導(dǎo)膽汁淤積性肝損傷的保護作用;測定肝內(nèi)膽汁酸外排轉(zhuǎn)運體bsep、mrp2及攝取轉(zhuǎn)運體ntcp表達,揭示ab23a對膽汁酸轉(zhuǎn)運的作用機制;測定膽汁酸合成酶cyp7a1、cyp8b1及上游轉(zhuǎn)錄因子shp、fgf15表達,揭示ab23a對膽汁酸合成的作用機制;測定膽汁酸代謝酶cyp3a11、cyp2b10、sult2a1及ugt1a1表達,揭示ab23a對膽汁酸代謝的作用機制;采用fxr拮抗劑gs阻斷fxr信號通路,評價ab23a肝保護作用是否與激活fxr有關(guān)。結(jié)果:(1)在小鼠部分肝切除實驗中,ab23a通過上調(diào)肝細胞增殖相關(guān)蛋白foxm1b,cyclind1和cyclinb1表達,劑量依賴性地促進了小鼠肝細胞增殖;ab23a通過抑制膽汁酸合成限速酶cyp7a1,誘導(dǎo)膽汁酸外排轉(zhuǎn)運體bsep表達,降低了肝內(nèi)膽汁酸水平、發(fā)揮出肝保護作用;ab23a對上述基因表達的影響、促肝再生及肝保護作用被fxr拮抗劑gs所阻斷;體外實驗表明ab23a對fxr靶基因的調(diào)控作用被fxr基因沉默所逆轉(zhuǎn);雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灪头肿訉訉嶒炦M一步證實了ab23a對fxr的激活作用。(2)在抗anit所致小鼠肝損傷及膽汁淤積實驗中,ab23a通過下調(diào)膽汁酸攝取轉(zhuǎn)運體ntcp,上調(diào)外排轉(zhuǎn)運體bsep、mrp2及mdr2表達,減少了肝臟對膽汁酸的攝取,增加了肝臟對膽汁酸的外排;通過抑制膽汁酸合成酶cyp7a1和cyp8b1的表達,降低了肝內(nèi)膽汁酸的合成,通過增加膽汁酸結(jié)合酶bal和baat的表達,增加了肝內(nèi)膽汁酸的結(jié)合;通過誘導(dǎo)ii相代謝酶sult2a1的表達,增加了肝內(nèi)膽汁酸的代謝。進一步通過體內(nèi)和體外實驗方法證實ab23a對anit所致肝損傷和肝內(nèi)膽汁淤積的肝保護作用是由于fxr介導(dǎo)的上述基因表達的調(diào)控。(3)在抗ccl4所致肝毒性實驗中,ab23a通過調(diào)節(jié)參與肝細胞dna復(fù)制及有絲分裂的重要基因foxm1b、cyclind1及cyclinb1的表達,促進了肝細胞的增殖;通過下調(diào)肝內(nèi)膽汁酸攝取轉(zhuǎn)運體ntcp和合成酶cyp7a1、cyp8b1的表達,上調(diào)膽汁酸外排轉(zhuǎn)運體bsep、mrp2的表達,降低了肝內(nèi)膽汁酸水平;此兩方面的作用與ab23a激活核受體fxr直接相關(guān);通過誘導(dǎo)p-stat3及stat3靶基因bcl-xl、socs3表達,減少了肝細胞的凋亡。(4)在雌激素誘導(dǎo)膽汁淤積性肝損傷實驗中,ab23a通過上調(diào)外排轉(zhuǎn)運體bsep和mrp2,下調(diào)肝臟膽汁酸攝取轉(zhuǎn)運體ntcp的表達,增加了肝臟對膽汁酸的外排,減少了肝臟對膽汁酸的攝取;通過抑制膽汁酸合成酶cyp7a1和cyp8b1的表達,降低了肝內(nèi)膽汁酸的合成;通過誘導(dǎo)ii相代謝酶sult2a1的表達,增加了肝內(nèi)膽汁酸的代謝。并進一步證實了ab23a對ee所致膽汁淤積性肝損傷的肝保護作用是由于fxr介導(dǎo)的上述基因表達的調(diào)控。結(jié)論:ab23a通過激活fxr,促進了小鼠部分肝切除后的肝再生;通過調(diào)控FXR介導(dǎo)的膽汁酸轉(zhuǎn)運體和合成酶對ANIT所致肝損傷及膽汁淤積具有保護作用;通過激活FXR和STAT3對四氯化碳所致肝小鼠肝毒性發(fā)揮保護作用;通過作用于FXR介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運體和酶對雌激素誘導(dǎo)膽汁淤積性肝損傷起到保護作用。
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【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R96

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本文編號：2425674